Diafiltrasyon

Diafiltrasyon, bir çözeltiden tuzlar, çözücüler ve mikro safsızlıklar gibi daha küçük çözünen maddeleri seçici olarak uzaklaştırarak, proteinler gibi hedef makromolekülleri saflaştırmak ve konsantre etmek amacıyla seyreltme işlemini ultrafiltrasyon ile birleştiren membran tabanlı bir ayırma tekniğidir.^[1] Bu işlem, geçirgen türlerin permeata (süzüntüye) geçmesine izin verirken daha büyük molekülleri retentatta (tutulan fazda) tutmak için tanımlanmış bir moleküler ağırlık kesim değerine (MWCO) sahip yarı geçirgen membranlar kullanır; bu sayede üründe önemli bir kayıp olmaksızın verimli tampon değişimi veya tuz giderme sağlanır.^[2] Genellikle membran kirlenmesini azaltmak için teğetsel akış filtrasyonu (TFF) modunda gerçekleştirilen diafiltrasyon, operasyon sırasında retentatı devridaim ettirerek ve tampon veya su gibi taze seyreltici ekleyerek işlem verimliliğini korur.^[3]

Diafiltrasyonun temel prensibi, hedef safsızlıklar için membranın eleme katsayısına (S) dayanır; burada diahacim sayısı (N_D)—eklenen seyreltici hacminin başlangıç besleme hacmine oranı olarak tanımlanır—safsızlık giderme verimliliğini belirler.^[1] Biyoproseslerde en yaygın kullanılan mod olan sabit hacimli diafiltrasyonda (CVD), seyreltici, besleme hacmini ve ürün konsantrasyonunu sabit tutmak için permeat akısına eşit bir oranda eklenir; bu durum, tam geçirgen çözünen maddeler (S = 1) için aşağıdaki denkleme göre kirletici seviyelerinde üstel bir azalmayla sonuçlanır:

$$C/C_0 = e^{-N_D}$$

Buna karşılık, değişken hacimli diafiltrasyon (VVD), seyreltici ekleme oranlarının permeat uzaklaştırma oranlarından farklı olduğu durumlarda hacim değişikliklerine izin verir; bu yöntem, uzaklaştırma oranlarını artırmak amacıyla belirli tutma katsayıları (R) için optimize edilebilir ve şu şekilde modellenir:

$$V/V_0 = e^{N(a-1)}$$

Burada a, seyreltici akışının permeat akışına oranıdır.^[1] Membran seçimi kritiktir; ürün kaybını en aza indirmek için MWCO hedef molekülün moleküler ağırlığından daha düşük seçilir ve yüksek geçirgenliğe sahip türler için genellikle 5–7 diahacim sonrasında %99’un üzerinde safsızlık giderimi sağlanır.^[2]

Diafiltrasyon, monoklonal antikorlar ve aşılar dahil olmak üzere biyolojik ürünlerin tampon değişimi, tuz giderme ve formülasyonu gibi akış aşağı (downstream) saflaştırma adımları için hayati öneme sahip olduğu biyofarmasötik üretiminde çok önemli bir rol oynar ve genellikle konsantrasyon için ultrafiltrasyon ile entegre edilir.^[3] Gıda ve süt endüstrilerinde, laktoz ve mineralleri uzaklaştırarak peynir altı suyu proteini izolasyonunu, içeceklerin alkolsüzleştirilmesini ve meyve sularında şeker fraksiyonlamasını kolaylaştırır; bu sayede atığı azaltırken ürün verimini ve kalitesini artırır.^[2] Ek uygulamalar, organik ekstraksiyon için atık su arıtımında kaynak geri kazanımını ve antibiyotik saflaştırması için farmasötik üretimi kapsar; bu da hassas moleküler ayırmalar gerektiren sektörlerdeki çok yönlülüğünü vurgular.^[2]

Temeller

Tanım

Diafiltrasyon, daha büyük makromolekülleri retentat akışında tutarken tuzlar ve küçük moleküller gibi geçirgen çözünen maddeleri bir çözeltiden seçici olarak uzaklaştırmak veya değiştirmek için seyreltmeyi filtrasyon ile bütünleştiren membran tabanlı bir ayırma tekniğidir.^[4] Bu işlem, tutulan türlerin konsantrasyonunu önemli ölçüde değiştirmeden bileşenlerin boyutlarına göre fraksiyonlanmasına izin verdiği için, saflaştırma veya tampon değişimi gerektiren uygulamalarda özellikle değerlidir.^[1]

Diafiltrasyonun temel operasyonu, karışımı yarı geçirgen bir membran boyunca sürmek için basınç uygularken besleme çözeltisine sürekli veya aralıklı olarak bir çözücü (genellikle su veya bir tampon) eklenmesini içerir.^[5] Membrandan geçebilen daha küçük çözünen maddeler süzüntü (permeat) içinde uzaklaştırılırken, membranın moleküler ağırlık kesim sınırının (MWCO) üzerindeki makromoleküller tutulur ve yeniden sirküle edilir.^[4] Temel bir şemada, besleme bir teğetsel akış filtrasyon sistemine girer; burada permeat istenmeyen çözünen maddeleri taşıyarak çıkar ve seyreltilmiş retentat, istenen saflık elde edilene kadar tekrarlanan işlemler için geri döngüye alınır.^[1]

Harici ekleme olmaksızın çözücüyü uzaklaştırarak çözünen maddeleri birincil olarak konsantre eden ultrafiltrasyonun aksine, diafiltrasyon, safsızlıkların yıkanmasını artırmak için aktif olarak seyreltici ekler; bu da iyonlar veya çözücüler gibi mikro çözünen maddelerin daha eksiksiz bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar.^[5] Bu ayrım, diafiltrasyonu yalnızca hacim azaltma yerine çözünen madde değişimi için ultrafiltrasyonun hedeflenmiş bir uzantısı haline getirir.^[4]

Çalışma Prensipleri

Diafiltrasyon, seçici dış katmanında tipik olarak 1 ila 100 nm arasında değişen gözenek boyutlarına sahip ultrafiltrasyon membranlarına dayanır; bu, basınç güdümlü çözücü akışını desteklerken makromoleküllerin daha küçük çözünen maddelerden boyut dışlamasına (size exclusion) dayalı olarak ayrılmasını sağlar.^[6] İşlem, çözünen maddeleri gözeneklere doğru taşıyan ve membran boyunca konvektif akış oluşturan transmembran basıncı (TMP) ile güçlendirilir; çözünen maddelerin reddi öncelikle gözenek boyutundan kaynaklanan sterik engelleme yoluyla gerçekleşir, ancak aynı zamanda membran veya çözünen madde yüküne bağlı elektrostatik etkileşimler ve çözünen maddeler ile membran materyali arasındaki hidrofobik afinite tarafından da modüle edilir.^[7]^[8]^[9] Mekanizmaların bu kombinasyonu, proteinler gibi daha büyük ve tutulan türlerin retentatta kalmasını sağlarken, tuzlar veya çözücüler gibi daha küçük ve geçirgen olanların permeata geçmesini sağlar.^[10]

Ayırma verimliliği, aşağıdaki gibi tanımlanan red (geri çevirme) katsayısı R ile nicelendirilir:

$$R = 1 – \frac{C_p}{C_r}$$

Burada C_p, permeattaki çözünen madde konsantrasyonunu ve C_r, retentattaki (veya görünür red için yığın beslemedeki) konsantrasyonu ifade eder.^[11]^[7] Terapötik proteinler gibi yüksek oranda tutulan türler için 0.99’u aşan R değerleri hedeflenir; bu, hedef kaybını %1’in altına indirirken geçirgen kirleticilerin neredeyse tamamen uzaklaştırılmasına izin verir; bu yüksek red oranı, verimde önemli bir azalma olmaksızın hassas tampon değişimini kolaylaştırır.^[7] TMP, besleme hızı, pH ve çözünen madde-membran etkileşimleri gibi faktörler R’yi etkiler; ideallikten sapmalar, tutulan çözünen maddelerin gözeneklerden kısmi konvektif sürüklenmesinden kaynaklanır.^[11]

İşlemin temelini kütle dengesi prensipleri oluşturur: Tamamen tutulan bir çözünen madde (R = 1) için, tampon ekleme hızı permeat uzaklaştırma hızıyla eşleştiğinden, sistemdeki hacim ve çözünen madde kütlesi korunur ve sabit hacimli diafiltrasyon sırasında retentattaki konsantrasyonu sabit kalır.^[12]^[13] Buna karşılık, geçirgen çözünen maddeler (R = 0) üstel olarak uzaklaştırılır ve normalize edilmiş konsantrasyon C/C₀ = e^-N şeklindedir; burada N, diafiltrasyon hacimlerinin sayısıdır (permeat hacminin başlangıç retentat hacmine bölümü); örneğin, altı hacim %99.5’in üzerinde uzaklaştırma sağlayarak kapsamlı bir saflaştırma sunar.^[13]^[14] Bu dengeler, sızıntısız ideal koşulları varsayarak, saflık ve verimi dengelemek için proses tasarımına rehberlik eder.

Konsantrasyon polarizasyonu ve kirlenme, permeat tarafındaki çözünen maddeleri tüketen ve reddedilenleri biriktiren konvektif taşınımdan kaynaklanan polarizasyon ve geri döndürülemez adsorpsiyon veya agregasyonu içeren kirlenme ile membran üzerinde çözünen madde açısından zengin bir sınır tabakası veya tortu oluşturarak zorluklar yaratır; her ikisi de direnci artırır ve verimi sınırlar. Bu durum, permeat akısını şu modellere göre azaltır: J = k ln(C_g / C_b), burada J akı, k kütle transfer katsayısı, C_g jel tabakası konsantrasyonu ve C_b yığın konsantrasyonudur.^[11]^[7]^[15] Teğetsel akış filtrasyonu, beslemeyi membran yüzeyine paralel olarak yönlendirerek (örneğin, modüllerde 3–6 m/s hızlarda) bu etkileri hafifletir; bu, sınır tabakasını bozan ve birikimi önleyen kayma kuvvetleri (shear forces) oluşturarak akıyı sürdürür ve membran ömrünü uzatır.^[7]^[16]

Tarihçe

Tıbbi Uygulamalardaki Kökenleri

Diafiltrasyon, 1960’ların ortalarında renal replasman tedavisinde öncü bir teknik olarak ortaya çıktı ve özellikle Lawrence W. Henderson tarafından 1967’de, difüzyonu içermeden sadece ultrafiltrasyon ve ardından sıvı replasmanı yoluyla konvektif temizlemeye dayanan bir kan temizleme yöntemini tanımlamak için isimlendirildi.^[17] Bu yaklaşımda, ultrafiltrat yarı geçirgen bir membran boyunca kandan sürekli olarak uzaklaştırılır ve hacim ile elektrolit dengesini korumak için fizyolojik bir sıvı ile değiştirilir; böylece böbreğin doğal filtrasyon süreci taklit edilir.^[18] Bu yenilik, diafiltrasyonun geleneksel difüzif diyaliz yöntemlerine alternatif olarak kullanımının teorik ve deneysel temelini özetleyen Henderson’ın temel makalesinde detaylandırıldı.^[19]

Diafiltrasyonun tıbbi kökenlerindeki kilit dönüm noktası, literatürde ilk kez üre ve diğer orta moleküler ağırlıklı çözünen maddeler gibi üremik toksinlerin, böbrek yetmezliği olan hastaların kanından membran tabanlı filtrasyon yoluyla uzaklaştırılmasının bir aracı olarak tanımlanmasıyla geldi.^[17] Bu konvektif strateji, membranlardan zayıf bir şekilde difüze olan daha büyük çözünen maddelerin temizlenmesini artırarak erken hemodiyalize göre avantajlar sundu ve daha fizyolojik, sürekli bir tedavi biçimi sağlayarak hemodiyalizin 1960’ların sonlarındaki daha geniş klinik kabulünden önce geldi.^[18] İlk deneyler, in vitro ve ex vivo olarak etkili çözünen madde giderimini gösterdi ve diafiltrasyonu, aralıklı diyalizin yetersiz olduğu durumlarda sürekli renal replasman tedavisi (CRRT) için uygulanabilir bir seçenek olarak belirledi.

Diafiltrasyonun erken benimsenmesi, özellikle o dönemdeki selülozik membranların düşük geçirgenliği ve seçiciliği gibi teknolojik sınırlamalarla kısıtlandı; bu durum, mütevazı ultrafiltrasyon hızlarına, yetersiz çözünen madde temizlenmesine ve uzatılmış tedavi sürelerine neden oldu.^[20] Ek olarak, süreç dengeyi korumak için seans başına tipik olarak 10-15 litre gibi mütevazı hacimlerde steril replasman sıvısı gerektiriyordu; bu da klinik ortamlarda büyük miktarlarda steril sıvı ihtiyacı nedeniyle lojistik ve enfeksiyon riskleri oluşturuyordu. Bu zorluklar, başlangıçtaki kullanımını, kronik uygulamalardan ziyade kısa süreli filtrasyonun önceliklendirildiği yoğun bakım ortamlarındaki akut böbrek hasarı (AKI) ile sınırladı.

1970’lere gelindiğinde diafiltrasyon, tek başına hemofiltrasyondan hemodiafiltrasyona evrildi ve toksin giderme ile sıvı yönetiminde genel verimliliği artırmak için konvektif sıvı değişimini difüzif çözünen madde transferi ile entegre etti.^[21] Bu hibrit yöntem, konvektif ve difüzif mekanizmaları dengeleyerek bazı erken eksiklikleri giderdi ve klinik uygulamada daha pratik CRRT uygulamalarının yolunu açtı.

Biyoproseslerdeki Gelişimi

Diafiltrasyonun biyoteknolojide benimsenmesi 1970’lerde başladı ve rekombinant DNA yöntemlerinin ortaya çıkmasıyla birlikte verimli protein saflaştırmasını sağlayan ultrafiltrasyon membran teknolojisindeki atılımlara paralel olarak 1980’ler boyunca hızlandı. İlk uygulamalar, rekombinant proteinlerin konsantre edilmesine ve tuzdan arındırılmasına odaklandı; burada diafiltrasyon, teğetsel akış koşulları altında protein bütünlüğünü korurken daha hızlı tampon değişimi sunarak geleneksel diyalizin sınırlamalarını ele aldı.^[22] Bu entegrasyon, biyoproseslerin ölçeklenebilir terapötik biyomolekül üretimine kaymasıyla hayati bir önem taşıdı; ilk ticari ultrafiltrasyon sistemleri 1970’lerin ortalarında peynir altı suyu proteini geri kazanımı için ortaya çıktı ve kısa sürede biyoteknoloji beslemelerine genişledi.^[23]

1990’lardaki önemli kilometre taşları, diafiltrasyonun endüstriyel iş akışlarında, özellikle tampon değişimi ve viral temizleme için standart bir kromatografi sonrası adım haline geldiği monoklonal antikor (mAb) üretiminde yerleşmesini işaret etti.^[24] Bu on yılda, optimize edilmiş hücre hatlarıyla rekombinant mAb titreleri yükseldikçe, diafiltrasyon yüksek saflıkta formülasyonu kolaylaştırdı, işlem adımlarını azalttı ve akış aşağı saflaştırma kaskadlarında verimi artırdı. Düzenleyici kurumlar, terapötik protein üretiminde saflık ve stabilite gereksinimlerini karşılamak için tampon değişiminde diafiltrasyonun güvenilirliğini kabul etti.

Teknolojik itici güçler arasında, 1980’lerde içi boş elyaf (hollow-fiber) ve düz levha membranlardaki iyileştirmeler yer aldı; bu iyileştirmeler, kirlenmeyi azaltarak ve protein yüklü akışlarda daha yüksek akı oranlarına izin vererek ölçeklenebilir teğetsel akış filtrasyonunu (TFF) destekledi.^[25] Düşük basınçlı polisülfon içi boş elyaflar gibi bu yenilikler, diafiltrasyonu laboratuvar ölçeğinden endüstriyel biyoreaktörlere taşıyarak, artan rekombinant terapötik talebini karşıladı.^[26] Düz levha konfigürasyonları, sürekli işleme için modüler tasarımlar sunarak genel biyoproses verimliliğini daha da artırdı.^[27]

Düzenleyici etkiler, ICH Q8 kılavuzlarına dahil edilmesiyle diafiltrasyonun statüsünü sağlamlaştırdı; bu kılavuzlar, farmasötik üretimde membran operasyonları için risk tabanlı süreç validasyonunu teşvik ederek tekrarlanabilirliği ve tasarımla kaliteyi (QbD) sağladı. Bu çerçeve, biyolojik ürünler için beklentilerle uyumlu olarak diafiltrasyon parametreleri için tanımlanmış tasarım alanlarının benimsenmesini teşvik etti ve biyoüretim validasyonunda küresel uyumu kolaylaştırdı.^[28]

Türler

Sabit Hacimli Diafiltrasyon

Sürekli diafiltrasyon olarak da adlandırılan sabit hacimli diafiltrasyon, değişim tamponunun retentata permeat akısına eşit bir oranda eklendiği, böylece işlem boyunca tutulan makromoleküllerin hacminin ve konsantrasyonunun sabit kalmasını sağlayan bir teğetsel akış filtrasyon tekniğidir. Bu yöntem, tuzlar veya çözücüler gibi daha küçük safsızlıkların permeat akışına geçmesine izin verirken proteinler gibi daha büyük molekülleri tutan yarı geçirgen bir membran kullanır. Kararlı hal koşulları, hassas biyomoleküllerin denatüre olabileceği dalgalanmaları önleyerek bunu büyük ölçekli operasyonlar için uygun hale getirir.^[2]^[11]

Süreç, besleme çözeltisinin kirlenmeyi en aza indirmek için membran yüzeyi boyunca sirküle edildiği bir teğetsel akış filtrasyon sisteminin kurulmasıyla başlar. Retentat sürekli olarak besleme tankına geri döndürülürken, taze tampon hacmi sabit tutmak için permeat çıkışına eşleşen hassas bir oranda tanka verilir. İletkenlik veya safsızlık seviyeleri gibi parametrelerin izlenmesi süreci yönlendirir; örneğin, tam geçirgen çözünen maddeler için yaklaşık beş diafiltrasyon hacminden sonra tuz konsantrasyonunda %99’un üzerinde bir azalma hedeflenir.^[13]^[2]

Bu mod, özellikle membranın hedef makromoleküller için yüksek tutma katsayıları sergilediği durumlarda tampon değişimi için önemli avantajlar sunar; çünkü eşdeğer saflık seviyelerine ulaşmak için kesintili alternatiflere göre daha az toplam tampon hacmi gerektirir. Düzgün konsantrasyon ve akış dinamiklerini sürdürerek, kayma gerilimini ve moleküler etkileşimleri azaltır, böylece ürün kaybı riskini düşürür ve hassas biyolojik materyaller için genel süreç yumuşaklığını artırır.^[11]^[2]^[29]

Temsili bir uygulama, monoklonal antikor (mAb) saflaştırmasıdır; burada sabit hacimli diafiltrasyon, afinite kromatografisinden sonra üretim tamponundan formülasyon tamponuna geçişi kolaylaştırır, antikor stabilitesini ve verimini korurken verimli safsızlık giderimi ve konsantrasyon ayarı sağlar.^[30]^[31]

Kesintili ve Değişken Hacimli Diafiltrasyon

Kesintili diafiltrasyon, toplu (batch) veya ardışık diafiltrasyon olarak da bilinir, laboratuvar ve küçük ölçekli biyoproseslerde tampon değişimi ve safsızlık giderimi için yaygın olarak kullanılan yinelemeli bir işlemdir. Bu modda, besleme çözeltisi önce hacmini azaltmak için ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilir (genellikle başlangıç hacminin bir kısmına kadar), böylece tutulan makromoleküllerin konsantrasyonu artırılır. Konsantre retentat daha sonra orijinal besleme hacmine eşdeğer bir hacimde taze tampon eklenerek seyreltilir ve ardından karışımı yeniden konsantre etmek için başka bir ultrafiltrasyon turu uygulanır. Bu seyreltme ve konsantrasyon döngüsü birçok kez tekrarlanır; tipik olarak tuzlar gibi küçük çözünen maddelerin ≥%99 giderimi için 5 döngü uygulanır.^[12]^[32]^[1]

Bu yaklaşım, her parti döngüsü sırasında hacim dalgalanmalarına izin vererek standart sürekli yöntem olan sabit hacimli diafiltrasyonla tezat oluşturur; bu durum ekipman gereksinimlerini basitleştirir ancak eşdeğer saflık seviyelerine ulaşmak için sabit hacimli süreçlere göre daha yüksek tampon tüketimi ile sonuçlanır. Özellikle laboratuvar ölçekli operasyonlar veya manuel karıştırmalı hücreler veya santrifüj cihazları gibi ekipman sınırlamaları nedeniyle sürekli tampon ekleme ve permeat uzaklaştırmanın hassas bir şekilde kontrol edilemediği senaryolar için uygundur. Kesintili diafiltrasyonun erken bir örneği, tekrarlanan döngülerin kromatografik saflaştırmadan önce protein çözeltilerinden yüksek tuz konsantrasyonlarını etkili bir şekilde uzaklaştırdığı protein tuzsuzlaştırma protokollerindeki uygulamasıdır.^[33]^[1]^[34]

Değişken hacimli diafiltrasyon, besleme hacminin işlem sırasında dinamik olarak değiştiği, genellikle tampon ekleme ve permeat uzaklaştırma oranları arasındaki uyumsuzluklardan kaynaklanan bir başka kararlı olmayan durum modunu temsil eder. Bu varyantta, retentat filtrasyondan önce veya filtrasyon sırasında tamponla tamamen seyreltilir; eğer seyreltici ekleme oranı permeat akısını aşarsa (oran $\alpha = q_d / q_p > 1$ olarak tanımlanır, burada q_d seyreltici akış hızı ve q_p permeat akış hızıdır), besleme tankında net bir hacim artışına yol açar. Bu mod, otomatik akış kontrollerinin olmadığı sistemlerde veya akıyı sürdürmek için seyreltilmekten fayda sağlayan viskoz beslemelerin işlenmesi gibi sabit hacmin korunmasının pratik olmadığı durumlarda kullanılır.^[1]

Sabit hacimli diafiltrasyon ile karşılaştırıldığında, değişken hacimli işlemler aynı çözünen madde reddi için eşdeğer diahacimlerden daha fazla tampon gerektirir, çünkü değişen hacim konsantrasyon gradyanlarını etkiler ve işlem süresini uzatır. Bununla birlikte, hacim genişlemesinin membran kirlenmesini önlediği makromolekül saflaştırma için erken biyoprosesler gibi kısıtlı kurulumlardaki toplu operasyonlar için esneklik sunar.^[1]^[35]

Uygulamalar

Biyoteknoloji ve İlaç Endüstrisi

Biyoteknoloji ve ilaç endüstrisinde diafiltrasyon, özellikle kromatografi süreçlerini takiben tampon değişimini kolaylaştıran ultrafiltrasyon/diafiltrasyon (UF/DF) adımları aracılığıyla biyolojiklerin saflaştırılmasında çok önemli bir rol oynar. Bu teknik, monoklonal antikorların (mAb’ler) elüsyon tamponlarından formülasyon tamponlarına geçişi, ürünü konsantre ederken tuzların, işlemle ilgili safsızlıkların ve konakçı hücre proteinlerinin (HCP’ler) uzaklaştırılması için esastır. Örneğin, mAb üretiminde, Protein A yakalamasından sonraki parlatma kromatografisi adımlarını izleyen diafiltrasyon, HCP seviyelerini yaklaşık 15 ppm’den (anyon değişim sonrası) 0.6 ppm’in altına düşürerek genel saflığı artırabilir.^[24]^[36] Ek olarak, retentatı sonraki viral filtrasyon için hazırlayarak entegre iş akışlarında virüs giderimine katkıda bulunur ve hücre kültürü türevi ürünlerden potansiyel viral kontaminantların uzaklaştırılmasını sağlar.

Diafiltrasyon ayrıca, mAb üretiminin son formülasyon aşamalarında agregatların ve HCP’lerin uzaklaştırılmasına yardımcı olur; burada stabilize edici koşullara tampon değişimi, agregasyona yol açabilecek yüksek dereceli yapı bozulmalarını en aza indirir. Orijinal tamponu polisorbatlar gibi eksipiyanlar içeren stabilite için optimize edilmiş bir tamponla değiştirerek diafiltrasyon, terapötik etkinlik ve güvenliğin sürdürülmesi için kritik olan agregat oluşumunun kontrolüne yardımcı olur. Akış aşağı işlemlerde (downstream processing), UF/DF rutin olarak ilk yakalama ve parlatma kromatografisi adımlarından sonra entegre edilir, yüksek titrelere (genellikle >100 g/L) verimli konsantrasyon ve subkutan uygulama için tampon ayarı sağlar, böylece dökme ilaç maddesine giden yolu kolaylaştırır.^[37]^[38]

Dikkate değer bir vaka çalışması, E. coli inklüzyon cisimciklerinden rekombinant insan insülininin üretimidir; burada diafiltrasyon, çözündürme ve sülfitoliz sonrası çökelme adımlarından kaynaklanan yüksek konsantrasyonlardaki üre ve tuzları etkili bir şekilde uzaklaştırmak için uygulanır ve %95–98 geri kazanım verimini korur. Bu adım, insülin öncüsünün enzimatik dönüşüm için uygun bir tamponda olmasını sağlar ve diafiltrasyonun yüksek değerli biyolojik üretimdeki ölçeklenebilirliğini vurgular.^[39]

Düzenleyici bir perspektiften bakıldığında, diafiltrasyon, biyolojiklerdeki endotoksinlerin ve agregatların hassas kontrolünü sağlayarak güncel iyi üretim uygulamalarına (cGMP) uyumu destekler. UF/DF süreçleri, süreç içi limitleri karşılamak için biyoyük (bioburden) ve endotoksin izlemeyi içerir; doğrulanmış membran temizleme ve saklama protokolleri kontaminasyon taşınmasını önler. Bu, özellikle endotoksin giderimi için hayati önem taşır, çünkü diafiltrasyon modundaki teğetsel akış filtrasyonu, endotoksin agregatlarını boyutlarına göre ayırarak seviyeleri enjekte edilebilir terapötikler için gereken farmakope eşiklerinin (örneğin <0.5 EU/mg) altına düşürür.^[40]^[41]

Gıda ve İçecek Endüstrisi

Diafiltrasyon, gıda ve içecek endüstrisinde, özellikle proteinler ve polisakkaritler gibi daha büyük bileşenleri korurken şekerler, tuzlar ve mineraller gibi küçük molekülleri seçici olarak uzaklaştırarak doğal ekstraktların konsantrasyonu ve saflaştırılması için çok önemli bir rol oynar. Süt ürünleri işlemede, ultrafiltrasyon sırasında peynir altı suyu proteinlerinden laktoz ve mineralleri ayırmak için yaygın olarak kullanılır, böylece yüksek değerli peynir altı suyu proteini konsantreleri (WPC’ler) ve izolatları (WPI’lar) üretilir.^[42] Bu işlem, hacmi korumak için retentata su eklenmesini içerirken istenmeyen çözünen maddelerin geçmesine izin verir ve laktoz ile minerallerin %90’ından fazlasını uzaklaştırarak WPC’lerde %80’e varan protein saflığına ulaşır.^[43] Örneğin, süt işlemede diafiltrasyon, peynir üretiminden gelen peynir altı suyu akışlarını rafine eder, proteinleri konsantre ederek besin takviyeleri, bebek mamaları ve fonksiyonel gıdalarda kullanımlarını artırır.^[44]

İçecek sektöründe diafiltrasyon, aroma bileşiklerinden ödün vermeden ürün stabilitesini ve duyusal nitelikleri iyileştirerek berraklaştırmayı ve alkolsüzleştirmeyi kolaylaştırır. Şarap ve bira için, retentatı suyla sürekli seyrelterek alkol içeriğini azaltmak amacıyla ters osmoz veya nanofiltrasyon membranları ile entegre edilir; bu, etanol ve diğer uçucuların geçmesine izin verirken polifenolleri, aromaları ve renklendiricileri tutar.^[45] Bu teknik, organoleptik özellikleri korurken %90-100 alkol azalması sağlayan toplu veya sürekli diafiltrasyon modlarının kullanıldığı düşük veya alkolsüz varyantların üretimi için özellikle değerlidir.^[46] Ek olarak, elma veya çay likörleri gibi meyve sularında diafiltrasyon, bulanıklığın giderilmesine ve şeker konsantrasyonunun ayarlanmasına yardımcı olarak raf ömrü uzatılmış daha berrak ürünler sağlar.^[47]

Bu endüstrilerde diafiltrasyonun benimsenmesi, küresel temiz etiketli (clean-label) içerik talebini karşılamak için saatte binlerce litre işleme kapasitesine sahip sistemlerle büyük ölçekli, uygun maliyetli operasyonları destekler.^[48] Ekonomik olarak, diafiltrasyon suyunun laktoz kristalizasyonu için yeniden kullanılması gibi su kullanımını ve permeat geri kazanımını optimize eder ve geleneksel yöntemlere kıyasla operasyonel maliyetleri %30’a kadar azaltır.^[49] Önemli bir avantajı, proteinlerin doğal yapısını ve işlevselliğini koruyan, ısı bazlı süreçlerle ilişkili denatürasyonu önleyen ve böylece nihai gıda ürünlerinde çözünürlüğü, emülsifikasyonu ve jelleşme özelliklerini artıran ılıman, ortam sıcaklığı koşullarıdır.^[50]

Süreç Tasarımı

Temel Parametreler ve Optimizasyon

Diafiltrasyon süreçlerinde transmembran basıncı (TMP), permeat akısını yönlendiren ve aynı zamanda membran kirlenmesini etkileyen kritik bir parametredir; verimliliği dengelemek ve jel tabakası oluşumunu önlemek için tipik çalışma aralıkları 0.5–3 bar’dır.^[51] Genellikle kayma hızı (4,000–16,000 s⁻¹) olarak nicelendirilen çapraz akış hızı, çözünen maddeleri membran yüzeyinden süpürerek konsantrasyon polarizasyonunu ve kirlenmeyi en aza indirmek için optimize edilmelidir.^[52] pH ve iyonik güç dahil olmak üzere tampon koşulları, protein denatürasyonunu veya agregasyonunu önlemek için numunenin özelliklerine uyacak şekilde ayarlanır; örneğin, çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve tampon değişimi sırasında agregasyonu önlemek için pH tipik olarak ürünün izoelektrik noktasından en az 0.5–1 birim uzakta tutulur.^[51]^[53]

Optimizasyon stratejileri, biyofarmasötik saflığı için genellikle 2–4 LRV (Log Reduction Value – Logaritmik Azaltma Değeri) gerektiren konakçı hücre proteinleri (HCP) veya DNA gibi safsızlıklar için hedef LRV’ye ulaşmaya odaklanır; bu değer, başlangıç-son safsızlık oranının 10 tabanındaki logaritması olarak hesaplanır.^[54] Diahacim sayısı (N) veya retentat hacmine göre değiştirilen tampon hacmi, membranın red katsayısına (R, tutulan çözünen madde oranı) göre ayarlanır; ürün için R ≈ 1 ve safsızlıklar için R ≈ 0 olan ideal durumlar için N ≈ 2.3 değeri %90 safsızlık giderimi sağlar, güvenlik faktörü olarak 2–3 ek diahacim eklenir.^[7] Ekonomik sürdürülebilirliği sağlamak için proses akısı, TMP-akı keşif deneyleriyle belirlenen metrekare başına saatte 20 litrenin (LMH) üzerinde hedeflenir.^[51]

Gerçek zamanlı izleme kontrolü artırır; hat içi (in-line) iletkenlik sensörleri, iyonik güç azalmalarını (örneğin, tamponun 0.1–10 mS/cm değerine uymak için 100 mS/cm’den düşüşü) ölçerek tuz giderimini takip eder.^[55] Permeat veya retentat hatlarındaki 280 nm’deki UV absorbansı, protein konsantrasyonunu izler ve potansiyel ürün kaybını tespit ederek absorbans stabilize olduğunda işlem bitiş noktasını sağlar.^[55]

Laboratuvardan (1–10 L) üretime (1.000+ L) ölçek büyütme, viskozite ve kirlenme dinamiklerini simüle etmek için temsili besleme akışları kullanarak TMP ve çapraz akış hızı oranlarını koruyarak tutarlı akıyı (>20 LMH) sürdürür.^[56] Bu yaklaşım sapmaları en aza indirir ve pilot ölçekli validasyon eşdeğer safsızlık temizliğini (örneğin, HCP için >3 LRV) doğrular.^[57]

Matematiksel Modelleme

Diafiltrasyonun matematiksel modellemesi, tuzlar veya küçük moleküller gibi geçirgen çözünen maddelerin uzaklaştırılmasını tahmin ederken proteinler gibi makromoleküllerin tutulmasını sağlamak için kütle dengesi prensiplerine dayanır. Bir diafiltrasyon işlemi sırasında retentatta kalan geçirgen bir çözünen maddenin oranı için temel denklem, besleme hacmindeki çözünen madde için kararlı olmayan durum (unsteady-state) kütle dengesinden türetilir. Sıfır red (R = 0) ile ideal geçirgen bir çözünen madde için konsantrasyon oranı şöyledir:

$$\frac{C}{C_0} = e^{-\frac{V_d}{V_r}}$$

Burada C, t zamanındaki çözünen madde konsantrasyonu, C₀ başlangıç konsantrasyonu, V_d eklenen diafiltrasyon tampon hacmi ve V_r retentat hacmidir.^[58] Bu üstel azalma, sabit hacim ve adsorpsiyon etkilerinin olmadığı varsayımıyla, çözünen maddenin retentattan sadece seyreltme ve permeasyon yoluyla tamamen reddedilmesi nedeniyle ortaya çıkar.^[1]

Eşzamanlı tampon ekleme ve permeat uzaklaştırma ile retentat hacminin (V_r) korunduğu sabit hacimli diafiltrasyonda, belirli bir uzaklaştırma oranı için gereken diahacim sayısı ($N = V_d / V_r$) şu şekilde verilir:

$$N = \frac{-\ln(C/C_0)}{1-R}$$

Burada R, çözünen maddenin red katsayısıdır. %99 uzaklaştırma için ($C/C_0 = 0.01$), $-\ln(0.01) \approx 4.605$ olduğundan, $N \approx 4.6 / (1-R)$ olur. Türetme, genel kütle dengesi denkleminden başlar:

$$\frac{d(V_r C)}{dt} = -J A (1-R) C$$

Burada J permeat akısı ve A membran alanıdır; sabit V_r ve J altında entegre edildiğinde $C = C_0 e^{-N(1-R)}$ üstel formu elde edilir. Bu yaklaşım, Donnan etkileri altındaki yüklü küçük moleküller gibi kısmi redde sahip çözünen maddeler için geçerlidir, ancak kararlı durum akısını varsayar.^[1]

Gelişmiş modeller, tampon gereksinimlerini ve işlem süresini etkileyen akı düşüşünü tahmin etmek için kirlenme etkilerini dahil eder. Yaygın bir yaklaşım, permeat akısının şu şekilde ifade edildiği jel polarizasyon modelini kullanır:

$$J = J_w \left(1 – \frac{C_{gel}}{C_{gel,max}}\right)$$

Burada J_w başlangıç su akısı, C_gel jel tabakası konsantrasyonu ve C_gel,max akının sıfıra yaklaştığı maksimum jel konsantrasyonudur. Bu doğrusal düşüş formu, çözünen madde giderimi sırasında değişken akının tahmin edilmesine izin vererek kütle dengeleri ile birleştirilip diafiltrasyon simülasyonlarına entegre edilir. Kapsamlı süreç tasarımı için Aspen Plus gibi yazılımlar, kirlenme kinetiği ve tampon değişimi ile membran modüllerini modelleyerek bu dinamikleri simüle eder ve hedef saflık için V_d‘yi optimize eder.^[59]

Bu modeller, monoklonal antikorlar için tampon değişimi gibi protein tuzsuzlaştırma uygulamalarındaki deneysel verilere karşı doğrulanmış olup, çözünen madde giderimi tahminleri 4-5 diahacimden sonra ölçülen konsantrasyonlardan %5’ten az sapma göstermektedir. Örneğin, sığır serum albümininin tuz giderimi ile ultrafiltrasyon/diafiltrasyonunda, simüle edilmiş profiller tuz seviyelerinde gözlemlenen üstel azalma ile eşleşerek, tipik biyoproses koşulları altında temel denklemlerin faydasını doğrulamaktadır.^[1]^[7]

Ekipman ve Membranlar

Membran Seçimi

Diafiltrasyon süreçlerinde membran seçimi, proteinler gibi hedef makromoleküllerin tutulmasını sağlarken tuzlar ve tamponlar gibi küçük moleküllerin geçişine izin veren moleküler ağırlık kesim değeri (MWCO) tarafından yönlendirilir. Tipik MWCO 1 ila 30 kDa arasında değişir ve 1 kDa’nın altındaki tuzlar membrandan serbestçe geçtiğinden, 50 kDa’dan büyük proteinlerin yüksek verimlilikle tutulmasını sağlar.^[60]^[61] Yaygın bir kılavuz, %90’dan fazla tutma elde etmek için tutulan türün moleküler ağırlığından 3 ila 5 kat daha küçük bir MWCO seçmektir.^[62]

Membran malzemeleri hidrofilikliklerine, düşük protein adsorpsiyonlarına ve proses koşullarıyla kimyasal uyumluluklarına göre seçilir. Rejenere selüloz, sulu protein çözeltileri için mükemmel biyouyumluluk ve düşük bağlanma sunar ancak aşırı pH veya organik çözücülere karşı sınırlı dirence sahiptir. Polietersülfon (PES), hidrofilik yapısı, alkali tamponlardaki sağlamlığı (pH 14’e kadar) ve yüksek kimyasal direnci nedeniyle tercih edilir; bu da onu biyofarmasötik uygulamalarda temizleme ve sanitasyon için uygun hale getirir. Poliviniliden florür (PVDF) asitlere ve bazlara karşı güçlü direnç sağlar ancak hidrofobik eğilimleri nedeniyle ön ıslatma gerektirebilir.^[63]^[64]

Performans, çözünen madde reddi ve permeat akısı gibi temel metriklerle değerlendirilir. Yüksek kaliteli membranlar, tampon değişimi sırasında minimum ürün kaybı sağlayarak hedef proteinler için %98’i aşan red oranlarına ulaşır. Permeat akışı tipik olarak standart çalışma koşulları altında (1-2 bar transmembran basıncında) 20 ila 100 LMH arasında değişir ve verimi minimum kirlenme ile dengeler.^[65] Bu metrikler, verimliliği azaltan jel tabakası oluşumunu önlemek için membranın besleme akışı bileşimiyle eşleştirilmesiyle optimize edilir.

Yeniden kullanılabilir membranlar için sanitasyon kritiktir; sodyum hidroksit (0.1–1 M) veya diğer ajanlar kullanan yerinde temizleme (CIP) protokolleri, bütünlüğü bozmadan akıyı başlangıç değerlerinin %90’ının üzerine çıkarır. PES ve PVDF membranlar, geniş bir pH aralığındaki (2–13) stabiliteleri nedeniyle CIP uyumluluğunda üstündür.^[63]

2010’lardan bu yana, çapraz kontaminasyon risklerini en aza indirmek, validasyon süresini azaltmak ve çok ürünlü tesislerde operasyonları kolaylaştırmak için biyoproseste tek kullanımlık membranlara doğru belirgin bir geçiş olmuştur. Bu eğilim, özellikle biyoteknolojideki tek kullanımlık kaset ve içi boş elyaf tasarımlarındaki gelişmelerle desteklenmiştir.^[66]^[67]

Sistem Konfigürasyonları

Diafiltrasyon sistemleri, makromolekülleri tutarken çözücülerin veya tampon çözeltilerin verimli değişimini kolaylaştırmak için, genellikle teğetsel akış filtrasyonu (TFF) kurulumları aracılığıyla tasarlanmıştır. Yaygın konfigürasyonlar arasında, daha küçük hacimleri yüksek hassasiyetle ve kolay kurulumla işlemek için kompakt kasetlere istiflenmiş düz levha membranlar kullanan laboratuvar ölçekli operasyonlar için kaset tabanlı sistemler bulunur. Bunlar, modülerlikleri ve azaltılmış tutma hacimleri nedeniyle özellikle ilk süreç geliştirme için uygundur. Buna karşılık, içi boş elyaf (hollow-fiber) modüller, üretim ölçekli uygulamalar için tercih edilir; hassas biyomoleküller üzerindeki kayma gerilimini en aza indirirken daha yüksek akış hızlarını ve daha büyük işleme kapasitelerini destekleyen boru şeklinde bir tasarım sunar.

Sistem tasarımındaki temel bir ayrım, tek geçişli ve parti devridaim modları arasındadır. Tek geçişli konfigürasyonlar, beslemeyi membran boyunca devridaim olmadan sürekli olarak işler; bu, minimum ürün manipülasyonu ve azaltılmış kontaminasyon riski gerektiren uygulamalar için idealdir, ancak daha yüksek tampon tüketimi gerektirir. Öte yandan parti devridaim sistemleri, retentatı bir besleme tankına geri döndürerek daha yüksek konsantrasyon faktörlerine ulaşmak için membran üzerinde birden fazla geçiş sağlar ve tampon verimliliğinin öncelikli olduğu büyük ölçekli diafiltrasyon için daha ekonomiktir.

Diafiltrasyon sistemlerinin temel bileşenleri arasında çapraz akış (retentat) ve permeat akışları oluşturmak için pompalar, transmembran basıncını (TMP) izlemek için basınç sensörleri ve diafiltrasyon sıvılarının kontrollü eklenmesi ve çıkarılması için tampon tankları bulunur. Otomasyon genellikle, pompa hızlarını ve valf konumlarını ayarlayarak sabit TMP sağlayan, böylece tutarlı akıyı koruyan ve çalışma sırasında membran kirlenmesini önleyen programlanabilir mantık denetleyicileri (PLC’ler) aracılığıyla sağlanır. Bu entegre kontroller, gerçek zamanlı ayarlamalara izin vererek ölçekler arasında süreç tekrarlanabilirliğini artırır.

Ölçek büyütme örnekleri bu sistemlerin uyarlanabilirliğini göstermektedir: Pilot ölçekli kurulumlar genellikle tam üretimden önceki ara testler için uygun olan 0.5-5 m² membran alanı kullanarak 50-500 L hacimleri işler.^[68] Endüstriyel ortamlardaki verim taleplerini karşılamak için 10.000 L’ye kadar işleyebilen ticari sistemler 50 m² veya daha fazla membran yüzeyi kullanabilir.

Sistem konfigürasyonlarındaki yenilikler, farmasötik uygulamalar için sterilliğe odaklanmıştır; 2000’lerde, kirleticilere maruz kalmayı en aza indiren tamamen kapalı işlemeyi sağlamak için kapalı döngü sistemler ortaya çıkmıştır. Bu tasarımlar, steril konektörler, tek kullanımlık bileşenler ve otomatik yerinde temizleme (CIP) döngülerini içerir ve biyoproses iş akışlarındaki biyoyük risklerini önemli ölçüde azaltır.

Avantajlar ve Sınırlamalar

Faydalar

Diafiltrasyon, biyoproseste önemli verimlilik avantajları sunar; özellikle kapsamlı ekipman yatırımlarına ihtiyaç duymadan ölçeklenebilir saflaştırmaya olanak tanıyan büyük ölçekli operasyonlar için uygundur. Tamponda 200–500 kat numune hacmi gerektiren ve günler sürebilen diyalizin aksine, diafiltrasyon %90’ın üzerinde zaman tasarrufu sağlar ve tampon tüketimini %98’den fazla azaltarak tek bir adımda 500 mL’yi aşan hacimler için uygun hale getirir. Bu işlem aynı zamanda, aşırı pH veya kimyasal ajanlar içeren daha sert yöntemlerin aksine, doğal yapıları koruyan ve denatürasyonu önleyen ılıman koşullar altında boyuta dayalı membran ayırmaya dayandığı için proteinler gibi hassas biyomoleküllere karşı naziktir. Siyanovirin-N gibi bitki ekstraktlarından rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında, ultrafiltrasyon/diafiltrasyonun (UF/DF), büyük kromatografi kolonlarına olan ihtiyacı en aza indirerek ve daha küçük ekipmanla hacim azaltmayı sağlayarak akış aşağı işleme maliyetlerini yaklaşık %15 oranında azalttığı gösterilmiştir.^[32]^[69]^[70]

Diafiltrasyonun çok yönlülüğü, jel filtrasyonu veya çoklu diyaliz döngüleri gibi geleneksel tekniklerden daha az adımda konsantrasyon, tampon değişimi ve safsızlık giderimini eşzamanlı olarak gerçekleştirme yeteneğinde yatmaktadır. Proteinler veya antikorlar gibi makromolekülleri tutarken tuzları, çözücüleri ve küçük moleküllü safsızlıkları etkili bir şekilde uzaklaştırarak, retentat hacminin 3–5 katı kullanılarak %99’dan fazla tampon değişimi sağlayabilir. Örneğin, bitki ekstraktlarından rekombinant protein saflaştırmasında, tek bir UF/DF adımı toplam çözünür proteinlerin %80’inden fazlasını (RuBisCO gibi konakçı kontaminantları dahil) uzaklaştırır; standart koşullar altında bu, hedef protein saflığını yaklaşık %70 geri kazanım oranlarıyla yaklaşık 3 kat artırırken, %90 kritik misel konsantrasyonunda SDS kullanan optimize edilmiş koşullar 20 kata kadar saflık artışı sağlayabilir (yaklaşık %20 geri kazanımla da olsa). Bu entegre yaklaşım, mikrolitreden endüstriyel ölçeklere kadar numune hacimlerini önemli bir numune kaybı veya kontaminasyon riski olmadan işleyerek hız ve kapasite açısından diyalizden daha iyi performans gösterir.^[32]^[69]^[71]

Çevresel bir perspektiften bakıldığında, diafiltrasyon, tampon geri dönüşümüne izin veren ve katı kalıntılar yerine arıtmaya uygun bir permeat akışı üreten kapalı döngü sistemleri kullandığından, diyaliz veya çöktürme yöntemlerinden daha az atık üretir. Diyalize kıyasla, aşırı tampon kullanımını en aza indirerek atık hacmini büyük ölçüde azaltır ve daha sürdürülebilir biyoüretim uygulamalarına katkıda bulunur. Örneğin, peynir altı suyu proteini işlemede, çok aşamalı diafiltrasyon, tek aşamalı operasyonlara göre su tüketimini %72’ye kadar azaltarak çevresel ayak izini daha da düşürür. Genel olarak bu özellikler, kromatografideki tampon ve reçine maliyetlerinin giderlere hakim olabildiği yüksek hacimli safsızlık temizliği için diafiltrasyonu kromatografiye uygun maliyetli ve çevre dostu bir alternatif olarak konumlandırır.^[32]^[70]^[72]

Zorluklar ve Çözümler

Diafiltrasyondaki birincil zorluklardan biri membran kirlenmesidir; özellikle çözünen maddelerin membran yüzeyinde biriktiği ve permeat akışını engellediği konsantrasyon polarizasyonundan kaynaklanan bir jel tabakasının oluşmasıdır. Bu fenomen, ultrafiltrasyon tabanlı sistemlerde proses verimliliğini sürdürmek için genellikle operasyonel ayarlamalar gerektiren önemli akı düşüşüne yol açar.^[73]^[74] Bunu ele almak için, çapraz akış hızlarının artırılması, kirleticilerin geri taşınmasını destekleyen daha yüksek kayma kuvvetleri (shear forces) oluşturur, böylece jel tabakası kalınlığını azaltır ve akı seviyelerini geri kazandırır.^[74] Ek olarak, darbeli (pulsatile) akışın uygulanması, tortu oluşumunu bozan ve fraksiyonlama sırasında çözünen madde iletimini iyileştirirken permeat akısını %25’e kadar artırabilen periyodik hız varyasyonları sunar.^[75]

Bir diğer önemli sorun, tuzlar veya küçük safsızlıklar gibi düşük reddedilen çözünen maddelerin uzaklaştırılmasıyla ilişkili yüksek tampon tüketimidir; bu durum, yeterli saflığa ulaşmak için büyük hacimlerde diafiltrasyon tamponu (son formülasyon adımları için genellikle 7–12 diahacim) gerektirir.^[7] Bu talep, daha düşük çözünen madde tutma katsayılarının, safsızlık giderimi için gereken üstel azalmayı uzatması, işletme maliyetlerini ve atık oluşumunu artırmasından kaynaklanır.^[7] Optimizasyon stratejileri, sürekli protein formülasyonunda yüksek ürün verimi ve safsızlık temizliğini korurken tampon kullanımını en aza indirmek için permeat akışlarını geri dönüştüren ters akımlı çok aşamalı işlemler gibi kademeli diafiltrasyon konfigürasyonlarını içerir.^[76] Nanofiltrasyon membranlarını entegre eden hibrit yaklaşımlar, ara maddeleri seçici olarak tutarak, boya-tuz veya benzeri çözünen madde sistemlerinde genel tampon hacimlerini azaltarak ayırmaları daha da iyileştirir.^[77]

Proteinler gibi tutulan makromoleküllerin kusurlu membran reddi yoluyla küçük sızıntıları oluşabileceğinden, ürün kaybı ince ama kritik bir zorluğu temsil eder; bu durum biyofarmasötik uygulamalarda verimi potansiyel olarak tehlikeye atabilir.^[78] Moleküler ağırlık kesim değerinin (MWCO) doğru seçimi, hedef molekülün moleküler ağırlığından 3 ila 6 kat daha küçük membranların seçilmesiyle bu durumu hafifletir ve tampon değişim döngüleri sırasında %95–99’un üzerinde tutma oranları sağlar.^[79] Bunu tamamlayıcı olarak, pH kontrolü protein konformasyonunu stabilize eder ve tutmayı artırır, çünkü varyasyonlar geçirgenliği artıran yapısal değişikliklere neden olabilir; örneğin, Fc-füzyon proteini işlemede yükleme pH’ının optimize edilmesi, uygun transmembran basıncı ve akı ayarlamalarıyla eşleştirildiğinde önemli kayıpları önler.^[80]

2020’lerden bu yana yaşanan son gelişmelerde, yapay zeka (AI) güdümlü kestirimci bakım, süreç doğrulamasına entegre edilen makine öğrenimi modelleri aracılığıyla kirlenme olaylarını tahmin ederek diafiltrasyon sistemlerinde membran ömrünü uzatmak için gelişmiş bir çözüm olarak ortaya çıkmıştır.^[81] Bu çerçeveler, proaktif müdahalelere (zamanında temizlik veya parametre ayarları gibi) olanak tanımak için akı, basınç ve çözünen madde konsantrasyonları gibi parametreler hakkındaki gerçek zamanlı sensör verilerini analiz eder; böylece duruş süresini azaltır ve ultrafiltrasyon-diafiltrasyon ünitelerindeki operasyonel döngüleri uzatır.^[82] Örneğin, diafiltrasyona uyarlanabilen membran biyoreaktör bağlamlarındaki açıklanabilir yapay zeka modelleri, akı düşüşü için yüksek tahmin doğruluğuna (R² 0.84’e kadar) ulaşarak operatörlerin koşulları optimize etmesine ve erken membran değişiminden kaçınmasına olanak tanır.^[82]