Tandem afinite saflaştırması

Tandem afinite saflaştırması (TAP), doğal protein komplekslerini hücresel ekstraktlardan fizyolojik koşullar altında izole etmek için tasarlanmış iki aşamalı bir afinite saflaştırma tekniğidir ve kompleks bileşimi veya işlevi hakkında önceden bilgi sahibi olmadan endojen ekspresyon seviyelerinde protein-protein etkileşimlerinin incelenmesini sağlar.^[1] Yöntem, hedef proteine kaynaştırılmış iki işlevli bir TAP etiketine dayanır; bu etiket tipik olarak kalmodulin bağlayıcı bir peptit (CBP), bir tütün oyma virüsü (TEV) proteaz kesim bölgesi ve Staphylococcus aureus A proteininden gelen iki immünoglobulin G (IgG) bağlayıcı alanından oluşur ve C-terminal etiketlemesi için CBP-TEV-A Proteini şeklinde düzenlenmiştir. İlk olarak 1999 yılında Saccharomyces cerevisiae mayasında geliştirilen TAP, az sayıda hücreden (örneğin 1-3 litre kültür) saflaştırma yapılmasına olanak tanır ve kütle spektrometrisi gibi aşağı akış analizleri için uygun, yüksek oranda saf kompleksler sağlama kabiliyeti nedeniyle proteomik uygulamalar için geniş çapta benimsenmiştir.^[1]

TAP prosedürü, A Proteini kısmının IgG immobilize edilmiş reçinelere spesifik olarak bağlandığı ve etiketli proteini ve onunla etkileşime girenleri berraklaştırılmış hücre lizatlarından yakaladığı ilk afinite adımıyla başlar.^[2] Bunu, kompleksi serbest bırakmak için TEV proteaz ile kolon üzerinde kesim işlemi izler; bu aşamada A Proteini alanı ve çoğu spesifik olmayan bağlayıcı reçineye bağlı olarak kalır. Elüat daha sonra, CBP etiketini bağlayan kalsiyum varlığında kalmodulin kaplı boncuklar kullanılarak ikinci bir afinite saflaştırmasına tabi tutulur; kalsiyum şelatör (örn. EGTA) ile sonraki elüsyon, yüksek oranda saflaştırılmış kompleksi serbest bırakır.^[2] Bu ardışık yaklaşım, arka plan kontaminasyonunu en aza indirir, tek adımlı yöntemlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek saflık elde ederken, kompleksin bütünlüğünü ve aktivitesini korur.^[3]

TAP, başlangıcından bu yana yüksek organizmalarda daha iyi verimlilik sağlamak için çeşitli etiket modifikasyonları yoluyla mayanın ötesinde memeli hücrelerine, bakterilere ve diğer ökaryotlara uyarlanmıştır.^[4] Temel uygulamalar arasında, binlerce kompleksi tanımlayan büyük ölçekli maya proteom çalışmalarında olduğu gibi protein etkileşim ağlarının sistematik olarak haritalanması ve splisozomlar veya kromatin yeniden modelleyicileri gibi makromoleküler yapıların fonksiyonel karakterizasyonu yer alır.^[1] Kütle spektrometrisi (TAP-MS) ile birleştirildiğinde, yeni yolakları ve hastalıklarla ilişkili kompleksleri ortaya çıkararak etkileşime girenlerin tarafsız bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırır; ancak geçici etkileşimler veya düşük bolluklu proteinler gibi zorluklar, indüklenebilir ekspresyon veya ortogonal etiketler gibi optimizasyonlar gerektirebilir.^[5] Genel olarak TAP, etkileşim biliminde (interaktomik) bir temel taşı olmaya devam etmekte, yapısal biyoloji ve ilaç keşfindeki gelişmeleri etkilemektedir.^[6]

Genel Bakış ve Prensipler

Tanım ve Amaç

Tandem afinite saflaştırması (TAP), TAP etiketi olarak bilinen ardışık bir epitop etiketinin ilgilenilen bir yem proteine kaynaştırılması yoluyla hücre lizatlarından doğal protein komplekslerini izole etmek için tasarlanmış iki aşamalı biyokimyasal bir tekniktir. Bu yöntem, multiprotein yapılarının, kompleksin bileşimi veya işlevi hakkında önceden bilgi sahibi olunmasını gerektirmeden, genellikle az sayıda hücreden fizyolojik etkileşimlerini koruyan koşullar altında yakalanmasını ve saflaştırılmasını sağlar.^[7]

TAP’nin temel amacı, protein-protein etkileşimlerini (PPI’ler) tanımlamak ve multiprotein komplekslerini yüksek özgüllükle saflaştırmak, böylece proteomik profilleme için kütle spektrometrisi gibi aşağı akış analizlerini kolaylaştırmaktır. Spesifik olmayan bağlayıcıların izolasyonunu en aza indirerek TAP, hücresel interaktomların sistematik olarak keşfedilmesini ve çeşitli organizmalardaki fonksiyonel protein modüllerinin karakterizasyonunu destekler.^[8]

Art arda iki afinite etiketinin kullanımı —tipik olarak ilk yakalama için A proteininin immünoglobulin G bağlayıcı bir alanı ve ardından sonraki elüsyon için kalmodulin bağlayıcı bir peptit— tek adımlı yöntemlere göre saflığı artıran sıkı bir iki aşamalı süreç sağlar. Bu ikili yaklaşım, arka plan kontaminasyonunu azaltır ve tek adımlı afinite saflaştırmalarının genellikle düşük özgüllük ve değişken verimlerden muzdarip olan sınırlamalarını ele alarak homojene yakın preparasyonlar elde eder. TAP, tek adımlı afinite saflaştırmasındaki bu zorlukların üstesinden gelmek için özel olarak geliştirilmiş olup, doğal komplekslerin daha güvenilir izolasyonunu sağlamıştır.^[7]^[8]

Temel Mekanizma

Tandem afinite saflaştırması (TAP), ilgilenilen proteine kaynaştırılmış çift etiketli bir sisteme dayanır ve protein komplekslerini doğal koşullar altında yüksek özgüllükle izole eden iki adımlı ardışık bir afinite yakalamasına olanak tanır. TAP etiketi tipik olarak bir proteaz kesim bölgesi ile ayrılmış iki farklı afinite modülünden oluşur; bu, ilk yakalamaya, ardından serbest bırakmaya ve spesifik olmayan kontaminantları en aza indirmek için ikincil saflaştırmaya izin verir. Bu mekanizma, hedeflenen kompleksin etkileşimlerini korurken zenginleştirilmesini sağlamak için etiketler ile ilgili ligandları arasındaki yüksek afiniteli etkileşimleri, bölgeye özgü proteoliz ile birleştirerek kullanır. Standart C-terminal konfigürasyonunda TAP etiketi, kalmodulin bağlayıcı bir peptit (CBP), ardından bir TEV proteaz kesim bölgesi ve ProtA alanından oluşur.

İlk saflaştırma adımında, Staphylococcus aureus A proteininden (ProtA) türetilen IgG bağlayıcı alan, immobilize edilmiş immünoglobulin G (IgG) boncuklarına sıkıca bağlanarak, yem proteinini ve onunla ilişkili kompleksi ham hücre lizatlarından yakalar. Bu etkileşim son derece spesifiktir ve nanomolar aralığındaki ayrışma sabitleriyle kompleksi denatüre etmeden verimli bir ilk zenginleştirmeyi kolaylaştırır. Bağlanan materyal daha sonra bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için yıkanır ve proteolitik kesim yoluyla serbest bırakılmaya zemin hazırlar.

Kalmodulin bağlayıcı peptit (CBP) gibi ikinci etiket, kesimden sonraki ardışık saflaştırma turunda çok önemli bir rol oynar. İlk adımdan sonra, tütün oyma virüsü (TEV) proteazı etiketler arasındaki belirli bir bölgeden kesim yaparak protein kompleksini hafif koşullar altında IgG boncuklarından serbest bırakır. Elüat daha sonra, CBP’nin yüksek afiniteyle (K_d ~10 nM) bağlandığı kalsiyum iyonlarının varlığında kalmodulin kaplı boncuklara uygulanır; kalsiyumun EGTA ile şelatlanması daha sonra saflaştırılmış kompleksi elüte eder. Bu ikincil bağlanma, yalnızca spesifik olarak salınan materyali yakalayarak numuneyi daha da rafine eder.^[9]

Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly (ENLYFQ/G, burada ↓ işareti Gln ve Gly arasındaki kesim noktasını belirtir) konsensüs dizisine sahip TEV proteaz bölgesi, protein kompleksini bozmadan kesin ve verimli bir salınım sağlamak için stratejik olarak iki etiket arasına yerleştirilmiştir. TEV proteazı, yüksek özgüllüğü, fizyolojik koşullar altında minimum hedef dışı kesimi ve doğal etkileşimleri sürdürmek için düşük sıcaklıklarda çalışabilme yeteneği nedeniyle seçilmiştir; 4-16°C’de 1-2 saat içinde substratların %90’ından fazlasını keser. Bu bölgeye özgü proteoliz, ilk ligandın (örneğin IgG boncukları) büyük kısmının bozulmadan kalmasını sağlayarak ikinci adıma kontaminasyon taşınmasını önler.^[9]

TAP’nin iki aşamalı doğası, tek afiniteli yöntemlere kıyasla arka plan proteinlerini önemli ölçüde azaltır ve tipik olarak kütle spektrometrisi gibi aşağı akış analizleri için uygun, homojene yakın preparasyonlar sağlar.

Tarihsel Gelişim

Kökenler ve İcat

Tandem afinite saflaştırması (TAP), 1999 yılında Bertrand Séraphin liderliğindeki Heidelberg, Almanya’daki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı’nda (EMBL) bir araştırma ekibi tarafından icat edilmiştir. Önemli katkıda bulunanlar arasında Guillaume Rigaut, Antonius Shevchenko, Beate Rutz, Matthias Wilm ve Matthias Mann yer almaktaydı ve bu yöntemi tek etiketli afinite saflaştırma stratejilerine kıyasla önemli bir gelişme olarak tasarladılar. Bu yenilik, doğal koşullar altında ardışık saflaştırma adımlarını kolaylaştıran ve aşırı ekspresyona gerek kalmadan endojen seviyelerde eksprese edilen proteinlerin izolasyonuna izin veren çift etiketli bir sistem tanıttı.^[1]

TAP’nin geliştirilmesi, hem maya hem de memeli sistemlerinde önemli spesifik olmayan bağlanma sorunları ile boğuşan immünopresipitasyon ve tek afiniteli saflaştırmalar gibi önceki tekniklerin eksiklikleri tarafından yönlendirilmiştir. Bu yaklaşımlar genellikle kirletici proteinlerin birlikte izolasyonuyla sonuçlanıyor, protein komplekslerinin kesin karakterizasyonunu ve gerçek etkileşimlerin tanımlanmasını engelliyordu. Birbirine dik (ortogonal) iki afinite modülü -A proteini alanı ve ardından proteazla kesilebilen bir bağlayıcı ile ayrılan kalmodulin bağlayıcı bir peptit- kullanan TAP, multiprotein yapılarının yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korurken arka plan gürültüsünü en aza indirmiştir.^[1]^[10]

Yöntemin çıkışı, 1999 yılında Nature Biotechnology dergisinde yayımlanan ufuk açıcı bir makalede detaylandırılmış olup, mucitler TAP’yi Saccharomyces cerevisiae mayasında, splisozomal Brr2-Prp16 alt kompleksi, nükleer gözenek kompleksi ve Arp2/3 aktin çekirdekleyici kompleks dâhil olmak üzere doğal protein komplekslerini saflaştırmak için uygulamışlardır. Bu gösterimler, TAP’nin mütevazı hücre miktarlarından ekstraksiyon ve saflaştırma sırasında kompleks stabilitesini koruma kapasitesinin altını çizmiş ve önceki yöntemleri tehlikeye atan ölçeklenebilirlik ile denatürasyondan kaçınma konusundaki erken dönem engellerini ele almıştır. Yaklaşımın çok yönlülüğü ve verimliliği, onu proteomik çalışmaları için hızla bir temel taşı hâline getirmiştir.^[1]^[3]

Evrim ve Önemli Kilometre Taşları

Mayada TAP’nin icadının ardından, erken iyileştirmeler, başta memeli sistemleri olmak üzere yöntemin daha geniş uygulanabilirlik için uyarlanmasına odaklanmıştır. 2003 yılında, vizon akciğer epitel hücreleri ve fare miyoblastları gibi hücre hatlarında proteinleri stabil bir şekilde etiketlemek için retroviral vektörler kullanılarak çok yönlü bir memeli tandem afinite saflaştırma ekspresyon sisteminin geliştirilmesiyle önemli bir adaptasyon elde edilmiştir. Bu yaklaşım, kalmodulin bağlayıcı peptidi (CBP) memeli ekspresyonu ile uyumluluğu artırmak için bir FLAG etiketi ile değiştirmiş ve SMAD3-HSP70 gibi yeni etkileşimlerin tanımlanmasını sağlamıştır.^[11]

2002 ve 2005 yılları arasında TAP, proteom çapında interaktom haritalamasını kolaylaştırmak için kütle spektrometrisi (MS) ile entegre edilmiştir. Gavin ve arkadaşlarının 2002’de gerçekleştirdiği çığır açıcı bir çalışma, TAP-MS’yi 725 etiketli maya proteinine uygulamış, 232 kompleksi saflaştırmış ve 1.400’den fazla etkileşimi tanımlayarak maya proteom organizasyonunun ilk sistematik görünümünü sağlamıştır. Bu entegrasyon, TAP’nin yüksek verimli analiz potansiyelini vurgularken, Krogan ve arkadaşlarının (2006) 2.357 yeme ve 7.123 etkileşime genişleyen sonraki maya çalışmaları 2000’lerin ortalarındaki zaman diliminde kalmıştır.

2000’lerin ortalarında, memeli uygulamaları gibi zorlu süreçler için verimi artırmak ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak amacıyla etiket optimizasyonları önemli kilometre taşları olmuştur. Bürckstümmer ve arkadaşları tarafından 2006’da tanıtılan GS-TAP etiketi, A Proteini ve CBP’yi G Proteini’nden gelen iki IgG bağlayıcı alan ve bir Strep-tag II ile değiştirerek, interaktom çalışmaları için spesifikliği korurken insan HEK293 hücrelerinde 10 kata kadar daha yüksek verim elde etmiştir. Benzer şekilde, 2007’de Gloeckner ve arkadaşları tarafından geliştirilen SF-TAP etiketi StrepII ve FLAG etiketlerini kullanarak saflaştırma süresini 2,5 saate indirmiş ve memeli hücrelerinde doğal kompleks izolasyonu için verimliliği artırmıştır. Bu modifikasyonlar, orijinal CBP tabanlı etiketin memeli koşulları altındaki düşük afinitesi gibi sınırlamalarını ele alarak daha sağlam uygulamaların önünü açmıştır.^[12]

2010’lu yıllar boyunca, veri analizi ve güvenilir büyük ölçekli haritalamayı sağlayan ortogonal doğrulamadaki iyileştirmelerle birlikte TAP-MS protokolleri standart hâle gelmiştir. Jeronimo ve arkadaşlarının (2007, sonraki çalışmalarda genişletilmiştir) gerçekleştirdiği 2010 başlarındaki çalışmalar gibi araştırmalar, 32 yemden yüksek yoğunluklu insan ağları oluşturmuş ve RNA polimeraz II komplekslerindeki yüzlerce etkileşimi belirlemiştir. 2015 yılına gelindiğinde, insan çalışmalarındaki kümülatif TAP-MS çabaları, çeşitli interaktomlarda 10.000’den fazla protein-protein etkileşiminin haritalanmasına katkıda bulunmuş ve TAP verilerini hastalığa bağlı yolak analizi için diğer afinite yöntemleriyle bütünleştiren kapsamlı kaynakları desteklemiştir.

2010’ların sonları ve 2020’lerde TAP, dinamik interaktom analizi (2018 itibarıyla) için kantitatif TAP-MS ve iyileştirilmiş saflaştırma verimliliği için histidin ile küçük peptit afinitelerini entegre eden HiP4 etiketi (2024) gibi yeni etiket sistemlerini içeren ilerlemelerle gelişmeye devam etmiştir. Bu gelişmeler, 2025 yılı itibarıyla protein komplekslerinin yapısal çalışmaları için kriyo-EM ve çapraz bağlayıcı MS ile entegrasyonları kolaylaştırmıştır.^[13]

Afinite Etiketleri

Standart A Proteini ve Kalmodulin Bağlayıcı Peptit Etiketleri

Standart tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketi, ardışık saflaştırma adımlarını mümkün kılmak üzere bir tütün oyma virüsü (TEV) proteaz kesim bölgesi ile birbirine bağlanan iki temel afinite modülünü içerir: A Proteini etiketi ve kalmodulin bağlayıcı peptit (CBP) etiketi.

A Proteini etiketi Staphylococcus aureus‘tan türetilmiştir ve her biri yaklaşık 6,6 kDa boyutunda olan iki IgG bağlayıcı alandan oluşur. Bu alanlar, yaklaşık 2 nM’lik bir ayrışma sabiti (K_d) ile tavşan IgG’sinin Fc bölgesine yüksek afiniteli bağlanmayı kolaylaştırır ve ilk saflaştırma adımında sağlam bir ilk yakalama sağlar.^[14]

CBP etiketi, iskelet kası miyozin hafif zincir kinazının kalmodulin bağlayıcı alanından türetilen 26 amino asitlik bir peptittir (dizi: KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL). İkinci saflaştırma adımında spesifik etkileşimi destekleyen, kalsiyum varlığında yaklaşık 10 nM’lik bir K_d sergileyen Ca²⁺‘ya bağlı bir şekilde kalmoduline bağlanır.^[15]^[16]

Orijinal kanonik TAP konfigürasyonunda etiket, yem proteininin C-terminaline protein-CBP-TEV-A Proteini olarak kaynaştırılır. Yaygın bir alternatif N-terminal konfigürasyonu ise etiketi A Proteini-TEV-CBP-protein şeklinde düzenleyerek A Proteini’nin ilk afinite adımına ve CBP’nin ikincisine aracılık etmesini sağlar. Bu düzenleme, A Proteini etiketinin ilk izolasyon için IgG reçinesine güçlü ve spesifik bağlanmaya aracılık etmesini sağlarken, CBP etiketinin doğal protein komplekslerini koruyarak Ca²⁺‘nın EGTA aracılı şelasyonu yoluyla sonraki adımda tersinir elüsyona olanak tanımasına izin verir. Toplam etiket boyutu yaklaşık 21 kDa’dır. Her iki yönelim de müdahaleyi en aza indirmek için proteinin topolojisine göre seçilir.

Varyant ve Alternatif Etiketler

Tandem afinite saflaştırmasını (TAP) çeşitli biyolojik sistemlere ve deneysel koşullara uyarlamak için araştırmacılar, temel iki adımlı saflaştırma ilkesini korurken standart A Proteini ve kalmodulin bağlayıcı peptit (CBP) kombinasyonunu değiştiren varyant etiketler geliştirmiştir. Bu varyantlar, memeli hücrelerinde düşük verim, spesifik olmayan bağlanma veya kararsız komplekslerde kovalent etkileşimlere duyulan ihtiyaç gibi sınırlamaları ele alır.^[17]

2006 yılında geliştirilen GS etiketi, standart TAP etiketindeki A Proteini’nin iki IgG bağlayıcı alanını, Streptococcus‘un (GS) G proteininden türetilen iki benzer alan, ardından bir TEV proteaz kesim bölgesi ve CBP yerine bir streptavidin bağlayıcı peptit (SBP) ile değiştirir. Bu modifikasyon verimi on kata kadar artırır ve endojen kalmodulin bağlayıcı proteinlerle arka plan etkileşimlerini azaltarak memeli hücrelerinde özgüllüğü iyileştirir ve daha küçük başlangıç materyali hacimlerinden protein komplekslerinin verimli bir şekilde saflaştırılmasını sağlar.^[12] GS etiketinin tasarımı, G proteininin memeli sistemlerinde yaygın olan belirli IgG alt sınıflarına daha güçlü bağlanmasından yararlanarak onu insan veya fare hücre hatlarındaki etkileşim proteomikleri için özellikle uygun hâle getirir.^[18]

2010’larda HaloTag, protein komplekslerinin kovalent ve stabil bir şekilde yakalanmasını gerektiren uygulamalar için bir varyant olarak ortaya çıkmıştır. Değiştirilmiş bir bakteriyel dehalojenaz (~33 kDa) olan HaloTag, katı desteklere veya reçinelere bağlı kloroalkan ligandlarla geri dönüşümsüz bir kovalent bağ oluşturarak proteaz kesimi olmadan doğal koşullar altında nazik bir elüsyona izin verir. Bu kovalent mekanizma geçici etkileşimleri stabilize eder ve biyotinlenmiş veya etiketlenmiş interaktörlerin reaksiyon sonrası yakalandığı yakınlık etiketleme (proximity labeling) çalışmaları için HaloTag’in ikincil afinite adımlarıyla birleştirilmesi gibi hibrit TAP iş akışlarına entegre edilmiştir. Örneğin, HaloTag füzyonları, çok alt birimli komplekslerin memeli lizatlarından yüksek verimlilik ve minimum ayrışma ile izolasyonunu kolaylaştırır ve zayıf veya dinamik çağrışımlar içeren senaryolarda kovalent olmayan etiketlerden daha iyi performans gösterir.^[19]^[20]

Alternatif etiket kombinasyonları arasında, ardışık bir Strep-tag II (streptavidin bağlanması için) ve ardından bir FLAG etiketi kullanan, toplam etiket boyutunu bakteriyel ekspresyon sistemleriyle daha iyi uyumluluk için ~4,6 kDa’ya düşüren Strep-II/FLAG (SF-TAP) sistemi yer alır. SF-TAP, ortogonal elüsyon stratejileri (Strep-II için biyotin ve FLAG için rekabetçi peptit) ile doğal koşullar altında 2,5 saatin altında hızlı iki aşamalı saflaştırma sağlayarak, A Proteini gibi daha büyük ökaryotik etiketlerin yanlış katlanmaya veya toksisiteye neden olabileceği prokaryotik proteinler için ideal hâle getirir.^[21]^[22] Ek olarak, BioID-TAP füzyonları, karmaşık biyotin ligaz BirA*’yı (BioID) yem proteinindeki bir TAP etiketiyle birleştirerek, yakınlardaki proteinlerin in vivo olarak yakınlığa bağlı biyotinilasyonuna ve ardından canlı hücrelerdeki geçici interaktörleri zenginleştirmek ve tanımlamak için streptavidin afinitesine ve ikincil TAP saflaştırmasına izin verir. Bu hibrit yaklaşım, uzamsal etiketlemeyi (~10 nm yarıçap) yüksek saflıkta izolasyonla birleştirir ve özellikle organellerde veya fizyolojik koşullar altında dinamik ağları haritalamak için yararlıdır.^[23]^[24]

Etkili varyant etiketleri temel tasarım kriterlerine bağlıdır: protein katlanması veya işlevi ile etkileşimi en aza indirmek için toplam boyutun 20 kDa’nın altında olması, ardışık adımlar sırasında çapraz reaktiviteyi önlemek için ortogonal bağlanma özgüllükleri ve temiz bir elüsyon için TEV gibi proteazlara erişilebilirlik. Etiket yönelimi (N-terminaline karşı C-terminali füzyonu), yem proteininin topolojisine göre seçilir; N-terminali etiketleri, C-terminalindeki sterik engellemeyi önlemek için salgılanan veya zara (membran) bağlı proteinlere uygundur, C-terminali etiketleri ise doğal N-terminali sinyallerini korumak için sitoplazmik proteinler açısından tercih edilir. Bu ilkeler, kompleksin bütünlüğünü korurken bakterilerden memelilere kadar tüm organizmalarda geniş bir uygulanabilirlik sağlar.^[17]^[25]

Saflaştırma Prosedürü

Protein Etiketleme ve Ekspresyon

Tandem afinite saflaştırması (TAP), genellikle yem (bait) olarak adlandırılan hedef proteinin, yem geninin ekspresyon vektörlerine verimli bir şekilde eklenmesini kolaylaştırmak için genellikle Gateway teknolojisi gibi rekombinasyonel klonlama sistemleri kullanılarak oluşturulan bir TAP etiketi kasetine genetik füzyonuyla başlar.^[26] Saccharomyces cerevisiae gibi maya sistemlerinde, TAP etiketli yapı homolog rekombinasyon yoluyla genoma entegre edilerek plazmit bakımına gerek kalmadan kararlı bir ekspresyon sağlarken, HEK293 gibi memeli hücrelerinde lentiviral vektörler yapıyı geçici veya kararlı entegrasyon için iletir ve E. coli gibi bakteriyel konaklarda, plazmitler çözünür TAP-füzyonlu proteinlerin aşırı ekspresyonunu mümkün kılar.^[27]^[28]^[29] CRISPR-Cas9 tabanlı yöntemler de TAP etiket kasetinin doğrudan yem geninin genomik lokusuna kesin ve endojen entegrasyonu için kullanılarak çeşitli konakçı sistemleri genelinde aşırı ekspresyon artefaktlarını en aza indirir.^[30]

N-terminal füzyonları hedefleme sinyallerine veya etkileşimlere bazen müdahale edebileceğinden, doğal katlanmayı ve işlevselliği korumak için TAP etiketi genellikle yem proteininin C-terminaline yerleştirilir, ancak proteine bağlı olarak her iki yönelim de test edilebilir.^[31] Başarılı etiket birleştirme ve ekspresyon, TAP etiketinin A Proteini alanına veya doğrudan yem proteinine karşı antikorlar kullanılarak Western blot yöntemiyle doğrulanır ve beklenen moleküler ağırlık teyit edilerek kesilmeler veya bozulmalar ekarte edilir.^[32]

Transfeksiyon veya transformasyonu takiben, konakçı hücreler saflaştırma için yeterli biyokütleye ulaşacak şekilde kültürlenir ve yeterli protein miktarı elde etmek için genellikle 1-10 L’lik hacimlere kadar ölçeklendirilir.^[33] Ekspresyon genellikle, protein seviyelerini senkronize etmek ve yapısal (constitutive) ekspresyondan kaynaklı toksisiteyi önlemek amacıyla ayarlanabilir aktivasyon için GAL1 promotörü altındaki mayada galaktoz ile veya memeli Tet-indüklenebilir sistemlerinde doksisiklin ile olduğu gibi kontrollü olarak indüklenir.^[34] TAP etiketinin kendisi, kalmodulin bağlayıcı bir peptit (CBP), ardından bir tütün oyma virüsü (TEV) proteaz kesim bölgesi ve A Proteini’nden alınan iki immünoglobulin G (IgG) bağlayıcı alandan oluşur,^[1] bu sayede sonraki afinite adımlarını mümkün kılar.

Adım Adım Afinite Saflaştırması

Tandem afinite saflaştırması (TAP) prosedürü, spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirirken doğal protein komplekslerini hücre lizatlarından izole etmek üzere tasarlanmış bir dizi ardışık biyokimyasal adımı içerir. Bu iki aşamalı afinite süreci, TAP etiketli proteinin ekspresyonundan sonra başlar ve kompleks bütünlüğünü korumak için doğal koşullar altında ekstraksiyona odaklanır. Yöntem, tipik olarak A proteini alanını hedefleyen ilk afinite adımı için IgG ile konjuge edilmiş boncuklar, ardından boncuk üzerinde proteolitik kesim ve kalmodulin boncukları kullanılarak kalmodulin bağlayıcı peptit (CBP) ile ikinci bir afinite adımı kullanır.^[2]

Adım 1: Doğal Koşullar Altında Hücre Lizizi Hücre lizizi, TAP etiketli proteini ve ilişkili komplekslerini serbest bırakmak ve aynı zamanda doğal etkileşimlerini korumak için gerçekleştirilir. Maya hücreleri (tipik olarak OD₆₀₀ = 1–2’de 3–6 L kültür) toplanır, peletlenir ve liziz işleminden önce sıvı nitrojende dondurulur. Liziz işlemi 6 mM Na₂PO₄, 4 mM NaH₂PO₄·H₂O, 150 mM NaCl, %1 NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM NaF ve bozunmayı önlemek için proteaz inhibitörleri (örn. PMSF, benzamidin ve pepstatin A içeren bir kokteyl) barındıran bir tampon içinde gerçekleşir. Mekanik parçalama, boncuk dövme (4°C’de 0,5 mm cam boncuklarla her biri 30 saniyelik 7-10 vuruş) veya French press (8,27 MPa’da 2-3 geçiş) kullanılarak yapılır ve ardından lizatı berraklaştırmak için santrifüjleme (örn. 4°C’de 30 dakika boyunca 25.000 × g) uygulanır. Bu adım, genellikle hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için düşük tuzlu bir tampona (örn. 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) karşı uygulanan diyaliz ile doğal kompleksler açısından zenginleştirilmiş çözünür bir ekstrakt sağlar.^[2]

Adım 2: IgG Boncukları ile İlk Afinite Saflaştırması Berraklaştırılan lizat, TAP etiketinin A proteini alanını yakalamak için IgG-Sepharose boncukları (100 mg lizat başına 100-200 µL) ile inkübe edilir. Bağlanma dönen bir platform üzerinde 4°C’de 2-12 saat boyunca gerçekleşir ve spesifik olmayan proteinler bağlanmadan kalırken spesifik birleşmeye izin verir. Boncuklar daha sonra bağlanmamış materyali uzaklaştırmak ve arka planı azaltmak için liziz veya yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, %0,1 NP-40) kullanılarak kapsamlı bir şekilde (her biri 10 mL ile 3-5 kez) yıkanır. Bu adım, yem proteinini ve onunla etkileşime girenleri boncuklar üzerinde izole ederek yüksek özgüllük elde edilmesini sağlar.^[2]

Adım 3: TEV Proteaz Kesimi Boncuk üzerinde yapılan kesim, A proteini ve CBP alanları arasındaki TEV tanıma bölgesini sindirerek protein kompleksini IgG matrisinden serbest bırakır. Yıkanan IgG boncukları, 100-500 ünite TEV proteaz takviyeli 1 mL TEV kesim tamponunda (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM KOAc, %0,1 NP-40, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT) yeniden süspanse edilir. İnkübasyon işlemi 16°C’de 1-2 saat (veya 4°C’de gece boyu) sürer ve verimliliği sağlamak için her 20 dakikada bir hafif ajitasyon uygulanır. Bu adım tipik olarak bağlı komplekslerin %70-90’ını süpernatana serbest bırakır; A proteini kısmını boncuklara bağlı bırakarak kontaminantların birlikte elüsyonunu (co-elution) en aza indirir. Elüat santrifüjleme ile toplanır (örn. 1 dakika boyunca 500 × g).^[2]

Adım 4: İkinci Afinite Saflaştırması ve Elüsyon TEV elüatı, kalmodulin-Sepharose boncuklarına (100-200 µL) CBP bağlanmasını sağlamak için CaCl₂ (nihai 2 mM olacak şekilde) ile ayarlanır. İnkübasyon, kalmodulin bağlayıcı tamponda (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM Mg(OAc)₂, 2 mM CaCl₂, 14 mM β-merkaptoetanol) 4°C’de 1-2 saat sürer. Kompleksi daha fazla saflaştırmak için boncuklar 10 mL bağlayıcı tamponla 3-5 kez yıkanır. Elüsyon, elüsyon tamponuna (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM Mg(OAc)₂, 10 mM EGTA, 10 mM β-merkaptoetanol) EGTA eklenerek (nihai 10 mM olacak şekilde) gerçekleştirilir; bu işlem kalsiyumu şelatlar ve CBP-kalmodulin etkileşimini bozar; tipik olarak, 4°C’de 30-60 dakika boyunca birden fazla fraksiyon hâlinde 1-2 mL elüat toplanır. Nihai saflaştırılmış kompleks ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilir (örn. 10-30 kDa kesme sınırına (cutoff) sahip spin kolonlar kullanılarak) ve -80°C’de saklanır. Bu iki aşamalı süreç, aşağı akış analizleri için uygun, yüksek oranda zenginleştirilmiş protein kompleksleri sağlar.^[2]

Yaygın Sorunların Giderilmesi Saflaştırma sırasında düşük verimler, birleşen proteinlerin sterik engellemesi veya uygunsuz etiket yöneliminden kaynaklı olarak TAP etiketinin erişilemezliğinden ortaya çıkabilir; bu da her iki afinite adımında da verimsiz bağlanmaya yol açar. Bu nedenle büyük ölçekli liziz öncesinde etiket ekspresyonunun ve erişilebilirliğinin Western blot aracılığıyla doğrulanması önerilir. Diğer sorunlar arasında taze inhibitör ilavesiyle ele alınan proteaz bozulması veya enzim konsantrasyonu ya da inkübasyon süresi optimize edilerek hafifletilen eksik TEV kesimi yer alır. Hücre kültürü hacminin büyütülmesi (örn. 10 L’ye), düşük bolluklu hedefler için genellikle genel geri kazanımı iyileştirir.^[2]^[35]

Güçlü Yönler ve Sınırlamalar

Avantajlar

Tandem afinite saflaştırması (TAP), protein komplekslerini izole etmek için sırasıyla immünoglobulin G (IgG) ve kalmodulin afinite kromatografisini kullanan iki aşamalı süreci aracılığıyla yüksek saflık elde eder, bu da tek aşamalı immünopresipitasyon yöntemlerine kıyasla çok düşük bir arka plan kontaminasyonuyla sonuçlanır.^[1] Bu ikili afinite yaklaşımı, ilk kesim adımında kullanılan tütün oyma virüsü (TEV) proteazı gibi spesifik olmayan bağlayıcıları ve tek bir saflaştırmada birlikte elüte olabilecek diğer kontaminantları etkili bir şekilde ortadan kaldırarak kütle spektrometrisi gibi aşağı akış analizleri için uygun daha temiz fraksiyonlar verir.^[1] Örneğin TAP, 2 litre kadar küçük kültürlerden belirli protein bantlarının saptanmasını sağlayarak, karşılaştırılabilir sonuçlar için 16 litreye kadar ihtiyaç duyan önceki yöntemlere göre önemli bir iyileşme sağlamaktadır.^[1]

Yöntem, fizyolojik kompleks stokiyometrilerini ve çeviri (translasyon) sonrası modifikasyonları koruyan hafif, denatüre edici olmayan koşullar altında çalışarak doğal protein etkileşimlerini muhafaza eder.^[3] Proteinler, kompleks yapıyı veya işlevi bozabilecek aşırı ekspresyon artefaktlarından kaçınılarak entegre etiketlerden doğal seviyelerinde eksprese edilir ve hafif elüsyon adımları —TEV proteaz kesimi ve kalsiyum şelasyonu kullanılarak— hassas etkileşimlerdeki bozulmayı en aza indirir.^[1] Bu doğruluk, in vivo ilişkileri yansıtacak şekilde Importin α’nın ilişkili faktörleriyle birlikte olduğu gibi, alt stokiyometrik ortakların birlikte saflaştırılmasına (copurification) olanak tanır.^[1]

TAP, kapsamlı bir optimizasyona gerek kalmadan kütle spektrometrisi veya elektron mikroskobisi uygulamaları için uygulanabilir olmasını sağlayarak, 4 litre maya gibi mütevazı kültür hacimlerinden sürekli olarak mikrogram (mikrogram cinsinden) miktarlarda saflaştırılmış kompleksler veren standartlaştırılmış protokoller aracılığıyla ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik sunar.^[3] Prosedürün rutin yapısı, deneyler genelinde U1 snRNP kompleksindeki 10 spesifik proteinin tamamının tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasıyla da gösterildiği üzere, otomasyon potansiyelini ve kompleks bileşenlerin güvenilir bir şekilde tanımlanmasını destekler.^[1]

Maliyet etkinliği açısından TAP, IgG-Sepharose ve kalmodulin-Sepharose boncukları gibi yaygın olarak bulunabilen reaktiflere ve genel kromatografi ekipmanlarına dayanarak toplam harcamaları düşük tutar ve tek bir ay içinde büyük ölçekli uygulamalara olanak sağlar.^[1] Bu erişilebilirlik, tescilli veya özel araçlar gerektirmeden farklı model organizmalar genelinde kullanım alanını genişletmektedir.^[3]

Dezavantajlar ve Zorluklar

Protein komplekslerini izole etmedeki yüksek özgüllüğüne rağmen, tandem afinite saflaştırması (TAP) belirli deneysel bağlamlarda faydasını sınırlandırabilecek çeşitli dezavantajlar sunar.^[36]

Zorlukların başında, immünoglobulin G reçinesine gece boyunca bağlanma gibi uzatılmış inkübasyon süreleri ve ardından kontrollü koşullar altındaki proteolitik kesim adımları nedeniyle tamamlanması tipik olarak 2-3 gün süren prosedürün zaman alıcı doğası gelmektedir. İki ardışık afinite kromatografisini ve etiket çıkarılmasını içeren bu çok adımlı süreç, yüksek verimli uygulamaları engelleyebilir ve zamanla protein bozunması riskini artırabilir.^[36]

TAP sıklıkla düşük verimlerle sonuçlanır, bunlar büyük ölçekli kültürlerden tipik olarak nanogram ile düşük mikrogram aralığında saflaştırılmış protein kompleksi şeklindedir; bu da ek optimizasyon olmadan yapısal çalışmalar gibi aşağı akış analizleri için yetersiz kalabilir.^[37] Bu mütevazı geri kazanımlar, eksik elüsyon ve ekspresyon veya saflaştırma sırasında potansiyel etiket kesimi dâhil olmak üzere ardışık adımlar sırasındaki kayıplardan kaynaklanmaktadır.^[36]

Boyutu yaklaşık 20 kDa olan çift etiketli sistem, yem proteininin ve onunla etkileşime girenlerin doğal işlevini, katlanmasını veya yapısını bozarak artefaktlar oluşturabilir ve potansiyel olarak eksik kompleks izolasyonuna veya etkileşim haritalamasında yanlış negatiflere (false negatives) yol açabilir.^[38] Bu tür bir müdahale, özellikle sterik engellemeye veya eklenen etiketlerin neden olduğu değişmiş lokalizasyona duyarlı proteinler için sorunludur.^[39]

Buna ek olarak TAP, zar (membran) proteinlerine uygulandığında önemli sınırlamalarla karşılaşmaktadır; zira bu hedefler standart doğal liziz tamponlarında zayıf çözünürlük sergiler ve protein komplekslerini dengesizleştirebilen veya afinite matrislerine bağlanma verimliliğini azaltabilen deterjanların kullanımını gerektirir.^[36] Bu durum, çözünür proteinlere kıyasla integral membran kompleksleri için genellikle daha düşük bir saflık veya verimle sonuçlanır.^[39]

Uygulamalar

Protein-Protein Etkileşim Çalışmaları

Kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş tandem afinite saflaştırması (TAP-MS), çeşitli organizmalardaki protein-protein etkileşimlerini (PPI’ler) haritalamak ve interaktomları aydınlatmak için temel bir yöntem hâline gelmiştir. Çift afinite adımları aracılığıyla yem proteinlerini kararlı etkileşim ortaklarıyla birlikte saflaştırarak TAP-MS, çoklu protein komplekslerinin aslına uygun koşullar altında tanımlanmasını sağlayarak, tek aşamalı afinite saflaştırmalarına kıyasla spesifik olmayan kirleticileri en aza indirir. Bu yaklaşım, kapsamlı etkileşim ağları oluşturmak için binlerce yemin sistematik olarak etiketlenip analiz edilebildiği yüksek verimli çalışmalar için özellikle uygundur.^[40]

TAP-MS iş akışı, yem proteininin ve onunla ilişkili kompleksinin ardışık olarak saflaştırılmasından sonra başlar ve genellikle peptitler üretmek için elüte edilmiş proteinlerin tripsin ile boncuk üzerinde sindirimini içerir. Bu peptitler daha sonra sıvı kromatografisi (LC) ile ayrılır ve diziye özgü analiz için iyonları parçalayan tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) kullanılarak tanımlanır. Gerçek interaktörleri arka plan gürültüsünden ayırmak için SAINT (Significance Analysis of INTeractome) veya CompPASS (Comparative Proteomic Analysis Software Suite) gibi hesaplamalı puanlama algoritmaları uygulanır; SAINT, güven puanları atamak için spektral sayımlara ve kontrol saflaştırmalarına dayalı olasılıksal modelleme kullanırken, CompPASS birden fazla kopyadaki av (prey) proteinlerini sıralamak için normalleştirilmiş D-skorları hesaplar. Yanlış pozitifler (false positives), bilindik kirleticilerin yer aldığı veri tabanlarına karşı karşılaştırılarak daha da filtrelenir ve böylece yüksek güvenilirlikte PPI veri setleri elde edilir.

Dönüm noktası niteliğindeki çalışmalar, TAP-MS’nin büyük ölçekli interaktom haritalamasındaki gücünü ortaya koymuştur. 2006’daki çığır açıcı bir çalışmada, Krogan ve arkadaşları TAP-MS’yi Saccharomyces cerevisiae‘deki 4.562 etiketli proteine uygulamış ve 547 stabil protein kompleksi hâlinde bir araya gelen 7.123 etkileşimi tanımlayarak maya interaktomunun ilk küresel görünümünü sağlamışlardır.^[41] Bunu insan sistemlerine genişleten Li ve arkadaşları tarafından 2015’te yapılan bir çalışma, 56 transkripsiyon faktörü üzerinde TAP-MS kullanmış, kromatinle ilişkili ve çözünür komplekslerde zenginleştirilmiş 2.156 yüksek güvenilirlikli PPI’yi ortaya çıkarmış ve nükleer süreçlerde yeni düzenleyici ağları açığa kavuşturmuştur.^[42] Bu veri setleri, kompleksleri transkripsiyon ve sinyalleşme gibi hücresel işlevlere bağlayan sonraki biyoinformatik analizlere de ışık tutmuştur.

Tanımlanan PPI’leri doğrulamak için genellikle, doğrudan veya kararlı ilişkileri doğrulamak amacıyla orijinal yemin birlikte saflaştırıldığını teyit etmek için varsayılan av (prey) proteininin etiketlendiği ve saflaştırıldığı karşılıklı (resiprokal) etiketleme kullanılır. Biyolojik tekrarlar genelindeki yeniden üretilebilirlik filtrelemesiyle birleştirilen bu ortogonal yaklaşım, iyi kontrol edilen deneylerde yanlış pozitifleri %5’in altına düşürür. Kantitatif (niceliksel) öngörüler için, hücre kültüründeki amino asitler tarafından stabil izotop etiketleme (SILAC) veya etiketsiz yöntemler TAP-MS’ye entegre edilir; SILAC, etkileşim stokiyometrisini tahmin etmek için ağır ve hafif etiketli peptitleri ayırt ederek komplekslerdeki çekirdek alt birimlerin çevresel (periferik) interaktörlerden ayırt edilmesini sağlar. Böylesi bir niceleme, histon değiştirici komplekslerinki gibi dinamik birleşmelerin incelendiği çalışmalarda kritik öneme sahip olmuştur.

Yapısal ve İşlevsel Analiz

Tandem afinite saflaştırması (TAP), özellikle kriyo-elektron mikroskobisi (kriyo-EM) ile entegrasyon yoluyla, yapısal biyolojiye uygun doğal protein komplekslerinin izole edilmesinde etkili olmuştur. TAP ile saflaştırılmış montajlar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için doğrudan ızgara (grid) hazırlığına uygulanabilir ve diğer yöntemlerle elde edilmesi zor olan makromoleküler yapıların görselleştirilmesini sağlar. Örneğin, 2010’larda ribozom biyogenezi ile ilgili çalışmalarda TAP, Ltv1 veya Rio2 gibi bileşenleri etiketleyerek mayadan pre-40S ribozomal alt birimlerini saflaştırmak için kullanılmış, atomik düzeye yakın bir çözünürlükte yapısal heterojenliği ve olgunlaşma ara maddelerini ortaya çıkarmak için kriyo-EM rekonstrüksiyonuna olanak tanımıştır.^[43]^[44] Benzer şekilde, erken dönem pre-60S öncüleri, Rpf1’in TAP etiketlemesi yoluyla izole edilerek montaj (birleşme) yolaklarının ve faktör konumlandırmasının kriyo-EM analizini kolaylaştırmıştır.^[45]

Yapısal aydınlatmanın ötesinde, TAP ile izole edilen kompleksler, saflaştırılmış yapılar içindeki enzimatik aktiviteleri araştırmak için fonksiyonel testleri destekler. Bu kompleksler üzerindeki in vitro kinaz testleri, sinyalleşme ve regülasyon için kritik olan fosforilasyon olaylarını değerlendirir; örneğin, TAP ile saflaştırılmış WNK4 kompleksleri OSR1 ve SPAK substratlarına karşı kinaz aktivitesi göstermiş ve iyon taşıma yolaklarındaki rollerini doğrulamıştır.^[46] Fosfataz testleri, benzer şekilde defosforilasyon kinetiğini değerlendirerek multiprotein makinelerindeki tersinir modifikasyonlara dair içgörüler sağlar. Bu testler, kontrollü koşullar altında aktivitenin niceliksel ölçümüne olanak tanıyan doğal kompleks bütünlüğünü genellikle muhafaza eder.

Öne çıkan uygulamalardan biri, transkripsiyon çalışmaları için RNA polimeraz II (Pol II) mekanizmasının saflaştırılmasını içerir, burada Rpb9 gibi alt birimlerin TAP etiketlemesi fonksiyonel inceleme için holoenzim kompleksleri sağlar. Saflaştırılan bu yapılar, transkripsiyon başlama ve uzamasını incelemek için kullanılmış, alt birim stokiyometrisini teyit etmek için ko-immünopresipitasyon (co-IP) veya promotör bağlantısı sırasındaki dinamik etkileşimleri izlemek için Förster rezonans enerji transferi (FRET) gibi tamamlayıcı tekniklerle doğrulanmıştır.^[47]^[48]

TAP sonrası biyofiziksel karakterizasyon, çok açılı ışık saçılımı ile birleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi (SEC-MALS) aracılığıyla kompleks mimari anlayışını daha da rafine eder; bu yöntem, şekil varsayımı olmadan mutlak moleküler kütleyi ve oligomerik durumu belirler. Örneğin, TAP ile saflaştırılmış Nup82 nükleer gözenek kompleksleri üzerindeki SEC-MALS, taşıma işlevleri için modüler birleşimlerini doğrulayan 1:1:1 stokiyometri ve ~400 kDa kütle ortaya koymuştur.^[49] Bu yaklaşım, aşağı akıştaki yapısal ve fonksiyonel yorumlamalar için gerekli olan TAP izolatlarının homojenliğini ve stabilitesini garanti eder.

Son Gelişmeler

Yeni Etiket Sistemleri

2020’den bu yana tandem afinite saflaştırma (TAP) etiket sistemlerindeki son yenilikler; özgüllüğü artırmaya, saflaştırma süresini azaltmaya ve özellikle insan hücre lizatları ile virüs-konak etkileşimleri gibi zorlu örneklerde, kütle spektrometrisi (MS) gibi aşağı akış analizleriyle uyumluluğu iyileştirmeye odaklanmıştır. Bu yeni etiketler, daha küçük epitoplar, daha ılımlı elüsyon koşulları ile spesifik olmayan bağlanmayı ve protein bozulmasını en aza indiren hibrit veya kesilebilir tasarımlar dâhil ederek geleneksel sistemlerin sınırlamalarını ele almaktadır.^[13]

2023 yılında tanıtılan HiP4 etiketi, yedi amino asitten (HHHDYDI) oluşan, ardışık nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) boncuk saflaştırması ve ardından HiP4’e özgü immünopresipitasyon yoluyla entegre TAP sağlayan kompakt bir histidin tabanlı sistemdir. Bu tasarım, arka plan gürültüsünü azaltarak insan hücrelerinde verimi ve seçiciliği iyileştirir ve onu fosfoproteomikler dâhil MS tabanlı interaktom çalışmaları için özellikle uygun hâle getirir; hepatit B virüsü X proteini (HBx) veya TARDBP ile ilişkili olanlar gibi etkileşime giren proteinlerin saflığı ile geri kazanımında standart kalmodulin bağlayıcı peptit (CBP) etiketlerinden daha iyi performans gösterir.

2025 yılında Strep/FLAG (SF-TAP) etiketi, ilk adımda streptavidin bağlanması için çift StrepII etiketleri ve ikinci adımda anti-FLAG antikorunun yakalanması için bir FLAG etiketi kullanılarak virüs-konak protein komplekslerinin verimli bir şekilde izole edilmesi için uyarlanmış olup, doğal koşullar altında yalnızca bir gün içinde tam ardışık saflaştırmaya olanak tanımıştır. Bu sistem, ökaryotik sistemler için kompleks bütünlüğünü koruyarak, proteaz kesimine ihtiyaç duymadan viral etkileşim ortaklarının tanımlanmasını kolaylaştırır.^[50]

2020’lerdeki diğer ilerlemeler arasında, bitki ekstraktlarından hızlı ve uygun maliyetli saflaştırma için GFP tuzak (GFP-trap) afinitesini proteaz aracılı serbest bırakma ile birleştirenler gibi yakala ve bırak (catch-and-release) tek adımlı hibrit yaklaşımlar^[51] ile afinite adımları sırasında ışık kontrollü elüsyon için azobenzen amino asitlerini içeren ışıkla değiştirilebilen etiketler yer almaktadır.^[52] Bu hibritler, tersinir bağlanma ve isteğe bağlı serbest bırakmayı (salıverilmeyi) sağlayarak iş akışlarını basitleştirir ve yüksek verimli yapısal biyolojideki uygulanabilirliği artırır. Daha önceki etiket varyantlarının üzerine kısaca inşa edilen bu yenilikler, protein işleviyle etkileşimi daha da hafifletmek için minimum epitop boyutu ve ortogonal elüsyon mekanizmalarına öncelik verir.

Modern Tekniklerle Entegrasyon

2020’lerde, kütle spektrometrisi ile birleştirilen tandem afinite saflaştırması (TAP-MS), fosforilasyon bölgeleri dâhil olmak üzere translasyon sonrası modifikasyonların haritalanmasını geliştirmek için çoklu omik yaklaşımlarla entegre edilmiştir. Bir polihistidin dizisi ile dört ek amino asitten (HHHDYDI) oluşan HiP4 etiket sisteminin geliştirilmesi, gelişmiş verimlilik ve özgüllükle tandem afinite saflaştırmasını kolaylaştırarak, TAP-MS aracılığıyla kapsamlı protein interaktom analizine olanak tanır. Bu etiket, deneysel tasarıma göre kapsamadaki spesifik niceliksel iyileştirmeler değişmekle birlikte, fosfoproteomik profillemeye uygun yüksek saflıkta örnekler sağlayarak aşağı akış çoklu omik iş akışlarını destekler.^[53]

TAP ve kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) arasındaki sinerji, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için homojen, doğal protein kompleksleri elde etmek üzere saflaştırma protokollerini optimize ederek yapısal biyolojiyi ilerletmiştir. Örneğin, Saccharomyces cerevisiae‘den gelen COMPASS histon metiltransferaz kompleksi için optimize edilmiş bir TAP stratejisi, %99’un üzerinde saflık ve 10 L kültürden 50 μg verim elde ederek, kriyo-EM örnek hazırlığı için kritik olan minimum bozunma ile bozulmamış alt birim bileşimini garanti eder. Bu entegrasyon, COMPASS çekirdek alt kompleksinin ayrıntılı yapısal karakterizasyonunu mümkün kılarak H3K4 metilasyonu için gerekli olan yapısal dinamikleri ortaya çıkarmıştır. Önceki çalışmalar 4 Å civarında çözünürlüklere ulaşırken, son optimizasyonlar atomik boyuta yakın ayrıntıları destekleyerek komplekslerin birleşimine ilişkin anlayışı artırmaktadır.^[54]^[55]

İlaç keşfinde TAP, canlı hücrelerde hedeflerin kovalent olarak yakalanmasına izin vererek afinite saflaştırması, yakınlık ligasyonu ve foto-çapraz bağlanmanın bir kombinasyonu yoluyla birincil hücre içi ilaç bağlayıcı proteinleri tanımlamak için TAP-DBP yöntemine uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, dTAG-13 bozundurucusu için sereblonun (CRBN) ve olaparib inhibitörü için PARP1’in kesin olarak tanımlanması ve ardından PARP1 hedefli bir PROTAC’ın (IC50 = 3,07 nM) geliştirilmesiyle gösterildiği gibi, ilaçla etkileşime giren ortakları biyotinlemek ve izole etmek için kimerik bir yem proteini (FLAG-HA-TurboID-FKBP12(F36V)) kullanır. TAP-DBP, daha önceki hedef bilgisine dayanmadan ilaç mekanizmalarını ve seçiciliği açıklamak için tarafsız, sistematik bir araç sağlar.^[56]

BioID veya onun daha hızlı bir varyantı olan TurboID gibi yakınlık etiketleme (proximity labeling) teknikleriyle TAP’nin melezleri, saflaştırma özgüllüğünü geçici ortakların in situ biyotinilasyonu ile birleştirerek canlı hücrelerdeki dinamik protein interaktomlarının incelenmesini sağlar. Bu füzyonlar, TAP’nin biyotinilasyon sonrası etiketli kompleksleri izole etmesine izin vererek, özellikle çözünmeyen veya zarla (membran) ilişkili proteinler için geleneksel yöntemlerin kaçırdığı zayıf veya kısa ömürlü etkileşimleri yakalar. Örneğin, BioID-TAP iş akışları, farklılaşma sırasındaki Ku kompleksi veya LSD1-CoREST gibi interaktomları haritalandırarak gerçek zamanlı hücresel bağlamlardaki düzenleyici ağları ortaya çıkarmıştır. Bu entegrasyon, TAP’nin kullanım alanını statik komplekslerin ötesine uzatarak uzamsal ve zamansal (spatiotemporal) dinamiklere genişletir.^[57]^[58]^[59]