Biyofilm

Biyofilm, hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi içine hapsolmuş, yüzeyle ilişkili mikrobiyal hücrelerden oluşan bir topluluktur.^[1] Bu topluluklar, mikroorganizmaların canlı veya cansız yüzeylere yapışmasıyla oluşur ve toplu hayatta kalmayı ve büyümeyi kolaylaştıran, temel olarak polisakkaritler, proteinler ve hücre dışı DNA’dan oluşan koruyucu bir balçık tabakası üretir.^[2] Biyofilmler, nehir yatakları ve diş plağı gibi doğal ortamların yanı sıra boru hatları ve tıbbi cihazlar gibi endüstriyel ortamlarda da her yerde bulunur ve buralarda inatçı enfeksiyonlara ve kontaminasyona katkıda bulunabilirler.^[1]

Biyofilm oluşumu tipik olarak, serbest yüzen (planktonik) mikropların bir yüzeye tersinir tutunmasıyla başlayan, ardından tersinmez yapışma, mikrokoloni gelişimi, üç boyutlu yapının olgunlaşması ve nihayetinde hücrelerin yeni bölgeleri kolonize etmek üzere dağılmasıyla devam eden çok adımlı bir süreçte gerçekleşir.^[3] Bu EPS matrisi sadece topluluğu sabitlemekle kalmaz, aynı zamanda gömülü hücreleri antibiyotikler, konakçı bağışıklık tepkileri ve dezenfektanlar dahil olmak üzere çevresel streslerden koruyarak biyofilmleri planktonik benzerlerine göre antimikrobiyal ajanlara karşı 1.000 kata kadar daha dirençli hale getirir.^[4] Klinik bağlamda, biyofilmler kronik yaralar, implantla ilişkili osteomiyelit ve cihazla ilişkili bakteriyemi gibi insanlardaki bakteriyel enfeksiyonların yaklaşık %80’inde rol oynamakta, tedavi zorluklarını şiddetlendirmekte ve küresel antimikrobiyal direnç artışına katkıda bulunmaktadır.^[5]

Patojenezin ötesinde, biyofilmler su sistemlerinde besin döngüsünü ve kirli topraklarda biyoremidasyonu sağlayarak temel ekolojik roller oynarken; endüstride biyokirlenme ve korozyon yoluyla yıllık milyarlarca dolar olduğu tahmin edilen önemli ekonomik yükler oluşturur.^[6] Araştırmalar, zararlı etkilerini hafifletmek için çekirdek çoğunluğu algılama (quorum-sensing) inhibitörleri ve yeni yüzey kaplamaları dahil olmak üzere biyofilm oluşumunu bozma stratejilerini araştırmaya devam etmektedir.^[3]

Tanım ve Özellikler

Tanım

Biyofilm, bir yüzeye geri döndürülemez şekilde yapışmış ve temel olarak polisakkaritler, proteinler ve DNA’dan oluşan, kendi ürettiği hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi içine hapsolmuş yapılandırılmış bir mikrobiyal hücre topluluğu olarak tanımlanır.^[1] Bu matris, yapısal bütünlük ve koruma sağlayarak mikropların serbest yüzen, planktonik benzerlerinden farklı davranışlar sergilemesini sağlar.^[7]

Bireysel mikrobiyal hücrelerin sulu ortamlarda hareketli, dağınık bir halde bulunduğu planktonik büyümenin aksine, biyofilmler doğal ortamlarda baskın olan yerleşik bir yaşam tarzını temsil eder.^[1] Tahminler, biyofilmlerin Dünya’daki mikrobiyal yaşamın yaklaşık %80’ini oluşturduğunu ve su sistemlerinden konakçı dokularına kadar çeşitli habitatlardaki yaygınlığını vurgulamaktadır.^[8] Biyofilm oluşumuna geçiş; ilk yüzey tutunması, EPS matrisinin üretimi ve hayatta kalmayı ve kaynak kullanımını artıran hücreler arası çok hücreli benzeri koordinasyonun geliştirilmesi dahil olmak üzere temel ön koşulları içerir.^[7]

Biyofilm kavramı, 1860’larda fermente maddelerdeki mikrobiyal kümeleri fark eden Louis Pasteur’ün gözlemleri gibi erken mikrobiyolojik gözlemlere dayanmaktadır ve daha sonra, yüzeyle ilişkili bakteriyel toplulukları tanımladığı 1978 tarihli “Bakteriler Nasıl Yapışır” makalesi de dahil olmak üzere, 1970’lerin sonlarında Bill Costerton tarafından yapılan etkili araştırmalarla popüler hale getirilmiştir.^[9] Costerton’ın çalışması, bu toplulukların inatçı enfeksiyonlardaki rolünü vurgulayarak odağı izole hücrelerden organize mikrobiyal konsorsiyumlara kaydırmıştır.^[9]

Fiziksel ve Kimyasal Özellikler

Biyofilmler, kendilerini planktonik bakteri topluluklarından ayıran, verimli iç taşıma ve yapısal bütünlük sağlayan karmaşık üç boyutlu mimarilere sahiptir. Bu yapılar genellikle, besinlerin akışını ve metabolik atıkların uzaklaştırılmasını kolaylaştıran su kanallarıyla birbirine bağlanan kuleler, sütunlar veya mantar şeklindeki kolonilerden oluşur ve topluluk içinde sürdürülebilir mikrobiyal canlılığı destekler. Tipik biyofilm kalınlıkları 10 ila 100 μm arasında değişir ve genel sıkılığı korurken heterojen mikro ortamların gelişmesine izin verir.^[10]^[11]^[12]

Biyofilmlerin ayırt edici bir özelliği, özellikle antimikrobiyal ajanlara karşı gösterdikleri ve serbest yüzen hücrelerden 10 ila 1000 kat daha toleranslı olmalarını sağlayan gelişmiş kimyasal dirençtir. Bu dayanıklılık, fiziksel bir bariyer görevi görerek antibiyotik penetrasyonunu ve difüzyonunu engelleyen hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi dahil olmak üzere birçok faktörden kaynaklanır. Ayrıca, biyofilm içindeki yavaş büyüyen hücreler metabolik aktivitenin azalması nedeniyle aktif süreçleri hedefleyen antibiyotiklerin etkinliğini sınırlarken, “persister” (inatçı) hücreler —uyku halindeki bir alt popülasyon— ölümcül dozlarda hayatta kalır. Dışa atım pompaları, antibiyotikleri biyofilm hücrelerinden aktif olarak dışarı atarak toleransı daha da artırır.^[13]^[14]^[15]

Mekanik olarak biyofilmler, doğal veya konakçı ortamlarında karşılaşılan sıvı kayma kuvvetleri gibi çevresel streslere karşı dikkate değer bir uyum yeteneği gösterir. EPS matrisinin viskoelastik yapısı, kayma gerilimini sönümleyen bir viskozite sağlayarak kopmayı önler ve yapısal bütünlüğü korur. Biyofilm mukavemeti genellikle, sertlik ve esneklik arasında bir denge sağlayan yumuşak, jel benzeri bir kıvamı yansıtan ve tipik olarak 0,1 ila 10 kPa arasında değişen elastik modülü ile ölçülür.^[16]^[17]

Biyofilm içerisinde, dik besin gradyanları hücresel heterojenliği yönlendiren çeşitli mikro ortamlar yaratır. Oksijen seviyeleri dış katmanlardaki aerobik koşullardan daha derinlerdeki anaerobik çekirdeklere doğru azalırken, pH, fermantasyondan kaynaklanan asitler gibi lokalize metabolik yan ürünler nedeniyle değişebilir. Bu gradyanlar, dış hücrelerin aktif olarak solunum yapması ve iç hücrelerin anaerobik metabolizmaya veya uyku haline geçmesiyle mekansal olarak farklı hücre durumlarına yol açarak genel biyofilm fizyolojisini ve dayanıklılığını etkiler.^[12]^[18]^[19]

Oluşum ve Yaşam Döngüsü

İlk Tutunma ve Kolonizasyon

Biyofilm oluşumunun ilk aşaması, çevrede bulunan proteinler, polisakkaritler ve hümik maddeler gibi çözünmüş organik moleküllerin canlı veya cansız yüzeye hızla adsorbe olduğu yüzey koşullandırmasıyla başlar. Bu adsorpsiyon dakikalar ila saatler içinde gerçekleşerek yüzeyin kimyasal ve fiziksel özelliklerini değiştiren ince bir koşullandırma filmi oluşturur ve böylece mikrobiyal kolonizasyon için çekiciliğini artırır. Koşullandırma filmi, besin açısından zengin bir katman görevi görür ve yüzey ile yaklaşan bakteri hücreleri arasındaki elektrostatik itmeyi azaltarak sonraki tutunmayı kolaylaştırır. Örneğin, sulu ortamlarda bu film, doğal ve mühendislik sistemleri üzerine yapılan çalışmalarda gözlemlendiği gibi metaller, plastikler ve biyolojik dokular gibi malzemeler üzerinde her yerde oluşur.^[1]^[20]

Yüzey koşullandırmasını takiben, planktonik bakteriler —serbest yüzen, hareketli hücreler— koşullandırılmış yüzeye tersinir bir şekilde tutunur. Bu faz, aktif hareketliliği ve yüzeyin araştırılmasını sağlayan kamçı (flagella) gibi uzantılar aracılığıyla bakteri hücresinin kutbunda başlatılan; öncelikle van der Waals kuvvetleri, elektrostatik çekimler ve hidrofobik etkiler tarafından yönlendirilen zayıf, geçici etkileşimleri içerir. Pseudomonas aeruginosa gibi bakteriler bu aşamayı örneklendirir; hücreler yüksek kayma kuvvetleri veya besin kıtlığı gibi koşulların elverişsiz olması durumunda kolayca ayrılarak planktonik bir yaşam tarzına geri dönebilirler. Bu tutunmanın tersinirliği, bakterilerin mekanosensörler aracılığıyla yüzey ipuçlarını algılama yeteneğinden etkilenen kritik bir kontrol noktasıdır ve uygun olmadıkça biyofilm büyümesine bağlılığı önler.^[21]^[22]

Tersinmez tutunmaya geçiş, bakterilerin yüzeyle güçlü, kovalent benzeri bağlar oluşturmak için Escherichia coli‘deki tip 1 pilus veya E. coli ve Salmonella‘daki curli lifleri gibi protein yapılı adhezinler ürettiği, biyofilm kurulumuna yönelik bir taahhüdü işaret eder. Eş zamanlı olarak hücreler, bakterileri sıkıca sabitleyen ve ilk kümelenmeyi destekleyen, polisakkaritler ve proteinler dahil olmak üzere hücre dışı polimerik maddelerin (EPS) sentezini başlatır. Saatler içinde gerçekleşen bu süreç, hücreler bölündükçe ve EPS onları stabilite için sardıkça, biyofilmin temel birimleri olan mikrokolonilerin oluşumuna yol açar. Bu fazda ilk EPS’nin kısa süreli rolü, hücreler ve yüzey arasında köprü kurarak yapışma gücünü yalnızca fizikokimyasal kuvvetlerin ötesine taşımaktır.^[23]^[24]

Çeşitli çevresel faktörler, ilk tutunma ve kolonizasyonun verimliliğini modüle eder. Yüzey hidrofobikliği, bakteriyel membranlarla olumlu etkileşimler nedeniyle hidrofilik olanlara kıyasla daha fazla bakteriyel yapışmayı teşvik ederek bu aşamayı önemli ölçüde etkiler. Topoğrafya da kilit bir rol oynar; daha pürüzlü yüzeyler daha fazla tutunma alanı ve kayma kuvvetlerinden korunma sağlayarak kolonizasyon oranlarını artırır — örneğin, polimerler üzerindeki mikro pürüzlülük Staphylococcus tutunmasını artırır. Ek olarak, akış hızı gibi hidrodinamik koşullar kolonizasyonu etkiler: Düşük laminer akış pasif birikime izin verirken, türbülanslı veya daha yüksek kayma akışları hareketli hücreleri yüzeye çarparak nehirler veya tıbbi cihazlar gibi dinamik ortamlarda tutunmayı hızlandırabilir.^[25]^[26]^[27]

Olgunlaşma ve Gelişim

İlk mikrokoloni oluşumunu takiben, biyofilm gelişiminin olgunlaşma aşaması, devam eden bakteriyel hücre bölünmesi ve hücre dışı polimerik maddelerin (EPS) kademeli birikimi yoluyla bu kümelerin genişlemesiyle karakterize edilir. Bu genişleme, düz, yapışık katmanları, EPS’nin yapısal bütünlük ve koruma sağladığı karmaşık üç boyutlu mimarilere dönüştürür. Pseudomonas aeruginosa gibi model sistemlerde, bu büyüme aşaması tipik olarak birkaç gün içinde gelişir ve biyofilmin onlarca ila yüzlerce mikrometre kalınlığa ulaşmasını sağlar.^[28]

Olgunlaşma sırasındaki mimari evrimin önemli bir yönü, biyofilm hacminin %5-20’sini kaplayan ve besinlerin, oksijenin ve atık ürünlerin konvektif kütle taşınımı için kanallar görevi gören birbirine bağlı su kanallarının gelişimidir. Bu kanallar, daha derin biyofilm katmanlarına besin iletimini artırır ve çıkıntıları aşındıran ve akış dinamiğini optimize etmek için kanallaşmayı teşvik eden çevresel hidrodinamik kayma kuvvetleri tarafından derinden şekillendirilir. Akış koşulları altında büyütülen P. aeruginosa biyofilmlerinde, kayma gerilimi, gevşekçe yapışmış hücreleri seçici olarak ayırarak kanal oluşumunu etkiler ve daha aerodinamik, mantar benzeri bir morfoloji ile sonuçlanır.^[29]^[30]

Olgunlaşma sırasında kurulan besin gradyanları, biyofilm içinde özelleşmiş alt popülasyonların ortaya çıkmasına yol açarak hücresel farklılaşmayı yönlendirir. Bunlar arasında, antibiyotik maruziyeti ve açlık durumunda hayatta kalmak için uyku halinde, düşük metabolik duruma giren “persister” (inatçı) hücreler ve yapıyı güçlendirmek için EPS sentezini yoğunlaştıran matris üreten hücreler bulunur. Bu tür heterojenlik, özellikle biyofilmin iç kısımlarındaki lokalize besin sınırlamalarından kaynaklanır ve genel topluluk dayanıklılığını artıran bir iş bölümünü teşvik eder. Çekirdek çoğunluğu algılama (quorum sensing), EPS üretimi ve farklılaşma ipuçları için gen ekspresyonunu düzenleyerek bu geçişleri kısaca koordine eder.^[31]^[32]

P. aeruginosa ve benzeri sistemlerde biyofilm olgunlaşması için zaman çizelgesi, mikrokoloni kurulumundan (tutunma sonrası saatler ila günler) besin mevcudiyeti ve akış gibi çevresel faktörlere bağlı olarak günler ila haftalar içinde tam mimari karmaşıklığa doğru ilerler. Bu uzun aşama, statik kültürlerde 3. güne kadar artan antibiyotik toleransı gösteren çalışmalarla birlikte, biyofilmin koruyucu nişini sağlamlaştırır.^[33]^[34]

Dağılma ve Çözünme

Dağılma ve çözünme, mikrobiyal hücrelerin yerleşik topluluktan ayrılarak yeni yüzeyleri kolonize etmek veya çevresel baskılara yanıt vermek üzere tekrar planktonik duruma geçtiği biyofilm yaşam döngüsünün sonuç aşamasını temsil eder. Bu süreç, olgun yapı içindeki besin tükenmiş veya düşman koşullardan kaçışa izin vererek biyofilm oluşturan bakterilerin hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlar. Dağılma, her biri biyofilm kalıcılığı ve yayılmasının dinamik dengesine katkıda bulunan aktif veya pasif mekanizmalarla gerçekleşebilir.^[35]

Aktif dağılma, temel olarak, hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisinin parçalanmasını ve hareketlilik genlerinin aktivasyonunu koordine eden ve hedeflenen hücre salınımını sağlayan çekirdek çoğunluğu algılama (quorum sensing) sinyalleri tarafından düzenlenir. Önemli bir örnek, Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen ve adhezin genlerini baskılayıp polisakkaritler gibi EPS bileşenlerini bozarken kamçı hareketliliğini teşvik ederek dağılmayı indükleyen yağ asidi sinyali cis-2-dodesenoik asittir (cis-DA). DspI enzimi aracılığıyla sentezlenen bu sinyal, difüze olabilen otoindükleyicilerin, genellikle yüksek hücre yoğunluğuna veya stres sinyallerine yanıt olarak biyofilmden programlı bir çıkışı nasıl tetiklediğini örneklendirir.^[35]

Buna karşılık pasif dağılma, doğrudan hücresel kontrol olmaksızın biyofilm bütünlüğünü bozan dış fiziksel veya kimyasal kuvvetlerden kaynaklanır ve hücre kümelerinin veya agregatlarının kopmasına (sloughing) yol açar. Sıvı akışından kaynaklanan hidrodinamik kayma kuvvetleri biyofilm yüzeylerini aşındırabilirken, EPS’nin enzimatik bozunumu —örneğin aljinat veya amiloid liflerini hedef alan bakteriyel veya konakçı kaynaklı hidrolazlar tarafından— ayrılmayı kolaylaştırır. Bu mekanizmalar, aktif dağılmanın hassasiyetinin aksine genellikle düzensiz, spesifik olmayan salınımla sonuçlanır.^[36]^[37]

Dağılmanın adaptif önemi, besin arama veya enfeksiyon bölgelerini genişletmedeki rolünde yatar, özellikle kaynak sınırlamalarıyla karşılaşılan kronik durumlarda. Kararlı durum koşullarındaki olgun biyofimlerde, P. aeruginosa akış hücreleri gibi model sistemlerde günlük %1-5 olarak tahmin edilen küçük bir hücre fraksiyonu, topluluk döngüsünü sürdürerek yeni büyümeyi tohumlamak üzere ayrılır. Dağılma ayrıca, daha derin doku istilası yapabilen hareketli hücreleri serbest bırakarak enfeksiyonun yayılmasını teşvik eder. Özellikle, serbest kalan bu planktonik hücreler, statik biyofilm sakinlerine kıyasla, yukarı regüle edilmiş toksin üretimi ve artan antibiyotik toleransı gibi yükselmiş virülans faktörleri sergileyerek patojenezi potansiyel olarak şiddetlendirebilir.^[38]^[39]^[40]

Hücre Dışı Matris

Bileşim

Biyofilmlerin matrisini oluşturan hücre dışı polimerik maddeler (EPS); temel olarak polisakkaritler, proteinler, hücre dışı DNA (eDNA) ve lipitlerden oluşur ve polisakkaritler tipik olarak en büyük fraksiyonu oluşturur.^[41] Birçok bakteriyel biyofilmde, polisakkaritler EPS kuru ağırlığının %40-60’ını, proteinler %20-40’ını, eDNA %1-10’unu ve lipitler %1-10’unu oluşturur; ancak bu oranlar mikrobiyal türe ve çevresel koşullara göre değişebilir.^[42] eDNA genellikle topluluk içindeki bir hücre alt kümesinin otolizi yoluyla salınır ve matris stabilitesine katkıda bulunur.^[41]

EPS polisakkaritlerinin bileşimi, farklı nişlere adaptasyonu yansıtan önemli türe özgü değişkenlik gösterir. Pseudomonas aeruginosa‘da EPS; mannuronic ve guluronic asitlerin lineer bir kopolimeri olan aljinatın yanı sıra matriste yapısal çeşitlilik sağlayan katyonik polisakkaritler Psl ve Pel’i içerir.^[43] Buna karşılık, Staphylococcus türleri genellikle, biyofilm kohezyonu için gerekli olan ve kısmen deasetillenmiş bir polimer olan poli-N-asetilglukozamine (PNAG), diğer adıyla polisakkarit hücreler arası adhezinine (PIA) dayanır.^[44] Adhezinler ve enzimler gibi EPS’deki proteinler tipik olarak %20-30’u oluşturur ve ilk tutunma ile metabolik fonksiyonları kolaylaştırır.^[42]

Temel EPS bileşenlerinin biyosentezi, besin mevcudiyeti, pH ve stres sinyalleri gibi çevresel ipuçları tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Örneğin, P. aeruginosa‘da aljinat üretimi, genellikle oksidatif veya ozmotik stres altında yukarı regüle edilen ve yolaktaki hız sınırlayıcı enzim olan GDP-mannoz dehidrojenazı kodlayan algD geni tarafından kontrol edilir.^[45] Benzer şekilde, Psl ve Pel biyosentezi genleri, yüzey temasına ve çekirdek çoğunluğu algılama sinyallerine yanıt verir.^[43]

Niceliksel olarak EPS, biyofilmin kuru kütlesinin %50-90’ını temsil ederken, genel biyofilm toplam ağırlıkça %90’ın üzerinde su içerir ve bu da mikrobiyal hayatta kalmayı destekleyen hidratlı jel benzeri bir yapıyı mümkün kılar.^[46] Genellikle %95’i aşan bu yüksek su içeriği, matrisin nemli bir mikro ortamı sürdürmedeki rolünün altını çizer.^[42]

Yapısal ve İşlevsel Roller

Biyofilmlerdeki hücre dışı matris (ECM), mikrobiyal hücreleri topluluk kohezyonunu ve işlevselliğini artıran karmaşık üç boyutlu mimariler halinde organize eden birincil iskele görevi görür. Büyük ölçüde hidratlı polimerlerden oluşan ECM, hücrelerin kümeler, kuleler ve kanallar halinde mekansal düzenlemesini destekleyen jel benzeri bir ağ oluşturarak verimli kaynak dağılımını ve yapısal bütünlüğü teşvik eder. Bu iskele, CdrA gibi matris proteinlerinin hücreleri polisakkaritlere bağlayarak sağlam 3D organizasyon sağladığı Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinde gösterildiği gibi, mekanik kayma kuvvetlerine karşı biyofilm stabilitesini korumak için çok önemlidir. Vibrio cholerae‘den Bap1 hücre dışı matris proteininin 2025 kristal yapısı gibi son gelişmeler, bakteriyel biyofilm yapışma mekanizmalarına dair içgörüler sağlamıştır.^[47]^[48]

ECM’nin jel benzeri özellikleri, abiyotik ve biyotik tehditlere karşı temel koruma sağlar; nemi tutarak hücreleri toprak veya gelgit bölgeleri gibi değişken ortamlarda kurumaya karşı korur ve protozoan otçullar veya bakteriyofajlar gibi avcıları caydıran fiziksel bariyerler oluşturur. Örneğin deniz biyofilmlerinde matris, avcı penetrasyonunu engelleyerek bakteriyel hayatta kalma oranlarının planktonik hücrelere kıyasla önemli ölçüde artmasını sağlar. Polisakkaritler, bazı durumlarda ECM’nin ağırlıkça %98’e kadar su emmesini sağlayarak bu hidrasyon kapasitesine katkıda bulunur.^[49]^[50]^[51]

İşlevsel olarak ECM, polimerik bileşenlerindeki negatif yüklü bölgeler aracılığıyla temel iyonları ve organik molekülleri bağlayarak besin tutulmasını kolaylaştırır ve kıtlık sırasında hücreleri besleyen lokalize rezervuarlar yaratır; bu durum, ECM’ye bağlı kalsiyum gibi katyonların uzun süreli metabolik aktiviteyi desteklediği atık su biyofilmlerinde belirgindir. Ayrıca metabolik atık ürünleri izole ederek toksisiteyi azaltır ve yaşanabilir bir mikro ortam sağlar. Ek olarak, ECM’nin sulu kanalları, yakın hücre-hücre temasını ve konjugatif elemanların geçişini sağlayarak yatay gen transferini teşvik eder; bu durum matris eDNA’sının plazmit yayılma oranlarını artırdığı Vibrio cholerae‘de görülmektedir.^[42]^[52]^[50]

Savunma açısından ECM, difüzyon kısıtlamaları ve bağlanma etkileşimleri yoluyla antibiyotik penetrasyonunu engeller; sulu çözeltilere kıyasla genellikle 0,01’in altındaki etkili difüzyon katsayıları iç hücreleri korur. Bu mekanizma, matrisin antikor erişimini ve bağışıklık hücreleri tarafından fagositozu engelleyerek kistik fibrozis akciğerlerindeki gibi kronik enfeksiyonlarda temizlenmeyi azalttığı konakçı ilişkili biyofilmlerdeki bağışıklık kaçışına kadar uzanır.^[53]

ECM dinamik bir düzenleme sergiler ve strese yanıt olarak yeniden şekillenir; örneğin, Escherichia coli‘de öldürücü olmayan antibiyotik maruziyeti, yukarı regüle edilmiş EPS sentezini indükleyerek genel mimariyi bozmadan direnci artırmak için matrisi kalınlaştırır. Bu adaptif süreç, oksidatif stres veya kayma gibi tehditlere karşı yanıt verebilirliği sağlayan ECM bileşenlerinin enzimatik modifikasyonunu içerir.^[50]^[14]

Moleküler ve Hücresel Mekanizmalar

Çekirdek Çoğunluğu Algılama (Quorum Sensing) ve İletişim

Çekirdek çoğunluğu algılama (Quorum sensing – QS), biyofilm içindeki bakterilerin, hücre yoğunluğu arttıkça biriken difüze olabilen otoindükleyici moleküllerin üretimi yoluyla iletişim kurmasını ve davranışlarını senkronize etmesini sağlar. Bu yoğunluğa bağlı sinyalleşme, popülasyonların gen ekspresyonunu topluca düzenlemesine, çevresel değişikliklere uyum sağlamasına ve biyofilm kalıcılığı için gerekli topluluk düzeyindeki aktiviteleri koordine etmesine izin verir. Süreç ilk olarak, otoindükleyicilerin yüksek yoğunluklarda biyolüminesansı tetiklediği Vibrio fischeri‘nin LuxR-LuxI sisteminde kavramsallaştırılmış ve bu fenomeni tanımlamak için “çekirdek çoğunluğu algılama” terimi türetilmiştir.^[54]^[55]

Gram-negatif bakterilerde, açil-homoserin laktonlar (AHL’ler), LuxI homologları gibi enzimler tarafından sentezlenen ve LuxR tipi reseptörler tarafından algılanan birincil otoindükleyiciler olarak görev yapar. Bu sinyaller hücreler arasında yayılır ve eşik konsantrasyonlara ulaştığında —tipik olarak mL başına yaklaşık 10⁷ hücre yoğunluğunda— hücre içi reseptörlere bağlanarak hedef genlerin transkripsiyonunu aktive eden kompleksler oluşturur. Bu mekanizma, AHL birikiminin bireysel davranışlardan topluluk davranışlarına geçişi teşvik ettiği biyofilm oluşturan türlerde yaygındır.^[56]^[57]

Önde gelen bir örnek, önemli bir fırsatçı patojen olan Pseudomonas aeruginosa‘daki hiyerarşik QS sistemleridir. LasI tarafından üretilen ve LasR tarafından algılanan otoindükleyici N-(3-oksododekanoil)-homoserin lakton (3-okso-C12-HSL) içeren Las sistemi, ekzoproteazlar ve elastaz genleri dahil olmak üzere erken virülans genlerini aktive eder. RhlI’den gelen ve RhlR tarafından algılanan N-butanoil-homoserin lakton (C4-HSL) kullanan alt akış Rhl sistemi, ramnolipid üretimini ve sürü hareketliliğini (swarming) daha da koordine eder; LasR, sıralı aktivasyonu sağlamak için Rhl ekspresyonunu pozitif olarak düzenler. Bu sistemler, popülasyon yoğunluğuna yanıt olarak biyofilm dinamiklerini topluca ince ayarlar.^[58]^[59]

Gram-pozitif bakterilerde QS, streptokoklardaki yetkinlik uyarıcı peptit (competence stimulating peptide – CSP) gibi genellikle peptit bazlı sinyallere dayanır. ComAB taşıyıcısı tarafından ihraç edilen 17 amino asitli bir peptit olan CSP, membran reseptörü ComD’ye bağlanarak DNA alımı için yetkinlik genlerini indükleyen ComE aracılığıyla bir fosforilasyon kaskadını tetikler. Streptococcus pneumoniae gibi türlerde bu sistem yüksek yoğunluklarda aktive olur, genetik transformasyonu ve biyofilm olgunlaşmasını teşvik ederken diğer düzenleyici yollarla bütünleşir.^[60]^[61]

Biyofilm içerisinde QS, P. aeruginosa‘da LasR/RhlR’nin aljinat ve Pel/Psl polisakkaritlerini yukarı regüle etmesinde görüldüğü gibi, yapısal bütünlüğü artırmak için hücre dışı polimerik madde (EPS) üretimini senkronize eder. Ayrıca, rakipleri geride bırakmak ve besin alımını kolaylaştırmak için piyosiyanin ve fenazinler gibi toksin salınımını koordine eder. Ek olarak, QS sinyalleri EPS’yi bozarak veya hareketlilik genlerini indükleyerek dağılmayı tetikler, koşullar elverişsiz hale geldiğinde hücrelerin olgun biyofilmlerden çıkmasına izin verir, böylece yayılmayı teşvik eder. QS, plazmit alımını kolaylaştıran yetkinlik durumlarını artırarak yatay gen transferini kısaca etkileyebilir.^[59]^[58]^[62]

QS’yi bozmak, AHL laktonazlar veya asilazlar gibi enzimlerin otoindükleyicileri bozarak sinyal birikimini önlediği ve virülansı azalttığı “çekirdek çoğunluğu söndürme” (quorum quenching) yoluyla umut verici anti-biyofilm stratejileri sunar. LasR veya RhlR’yi hedefleyen sentetik inhibitörler, in vitro ortamda P. aeruginosa biyofimlerini zayıflatmada etkinlik gösterirken, deniz kaynaklarından elde edilen doğal çekirdek çoğunluğu söndürücüler, çeşitli türlerde EPS sentezini ve dağılmayı inhibe eder. Bu yaklaşımlar, dirence neden olmadan antibiyotiklere duyarlılığı geri kazandırmayı amaçlamakta ve QS’yi terapötik bir hedef olarak öne çıkarmaktadır.^[63]^[64]

Yatay Gen Transferi

Biyofilmlerdeki yatay gen transferi (HGT), mikrobiyal hücreler arasında genetik materyal alışverişini sağlayarak hızlı evrimi ve antibiyotik direnci gibi avantajlı özelliklerin yayılmasını teşvik eder. Bu süreç, hücrelerin birbirine yakın olduğu ve hücre dışı matris tarafından korunduğu yoğun, yapılandırılmış topluluklar nedeniyle biyofilmlerde özellikle verimlidir. Birincil mekanizmalar arasında her biri biyofilm spesifik koşullar tarafından güçlendirilen konjugasyon, transformasyon ve transdüksiyon yer alır.^[65]

Konjugasyon, plazmitlerin tip IV piluslar aracılığıyla hücreden hücreye temasla doğrudan transferini kolaylaştırarak donörlerin mobil genetik elementleri kopyalayıp alıcılara geçirmesine izin verir. Biyofilmlerde, yüksek lokal hücre yoğunluğu ve azalmış hareketlilik, serbest yüzen planktonik hücrelere kıyasla konjugasyon fırsatlarını artırır. Transformasyon, hücre dışı DNA’nın (eDNA) yetkin hücreler tarafından alınmasını içerir; biyofilmler, parçalanmış hücrelerden bol miktarda eDNA sağlar ve bunu hücre dışı polimerik maddeler (EPS) içinde nükleazlardan ve çevresel stres faktörlerinden korur. Transdüksiyon, konakçı DNA’sını paketleyip yeni hücrelere ileten bakteriyofajlar aracılığıyla gerçekleşir; sınırlı biyofilm alanı, daha yüksek faj-bakteri karşılaşma oranlarını destekleyerek bu mekanizmayı güçlendirir.^[66]^[67]

Biyofilmler; yüksek hücre yoğunlukları, EPS aracılı DNA koruması ve genetik elementleri lokalize tutan sınırlı difüzyonun etkisiyle, planktonik durumlara göre genellikle 10 ila 1.000 kat daha yüksek transfer oranlarına sahip HGT sıcak noktaları olarak işlev görür. Örneğin, Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerindeki konjugatif plazmit transferi, belirli koşullar altında 1.000 kat daha yüksek oranlarda gerçekleşir. Çekirdek çoğunluğu algılama (Quorum sensing), yetkinlik gelişimini ve pilus ekspresyonunu koordine ederek HGT verimliliğini düzenleyebilir. Önemli bir örnek, biyofilm modunda büyümenin planktonik kültürlere kıyasla transfer sıklığını önemli ölçüde artırdığı Klebsiella pneumoniae biyofilmlerinde IncX3 plazmitlerinin konjugasyonu yoluyla karbapenemaz kodlayan bla_{NDM-1} geninin yayılmasıdır. İntegronlar, bölgeye özgü rekombinasyon yoluyla direnç geni kasetlerini yakalayıp mobilize ederek kritik sıcak noktalar olarak hizmet eder ve çeşitli biyofilm topluluklarında HGT’yi daha da hızlandırır.^[68]^[69]^[70]

Biyofilm ilişkili HGT’nin evrimsel sonuçları büyüktür; antibiyotikler gibi stres faktörlerine hızlı adaptasyonu sağlar ve mikrobiyal popülasyonlarda genetik çeşitliliği teşvik eder. Büyüyen biyofilmlerdeki plazmit dinamiği modelleri, dikey kalıtımı geride bırakabilen ve yoğun topluluklarda dirençli soyların ortaya çıkmasını sağlayan HGT oranlarını öngörmektedir. Bu hızlandırılmış gen akışı, biyofilmleri doğal ve klinik ortamlarda mikrobiyal evrimin temel itici güçleri olarak konumlandırır.^[71]

Ekolojik ve Taksonomik Çeşitlilik

Doğal Habitatlar

Biyofilmler, nehir taşları gibi sert substratları ve okyanuslar ile nehirlerdeki yumuşak tortuları kolonize ettikleri su sistemlerinde yaygındır. Bakteriler, algler ve mantarların hücre dışı polimerik maddelere (EPS) gömülmesiyle oluşan nehir taşları üzerindeki epilitik biyofilmler, çözünmüş organikleri özümseyerek ve mikrobiyal metabolizma yoluyla azot ve fosforu geri dönüştürerek besin döngüsünde kilit bir rol oynar.^[72] Okyanus tortularında, diatom-bakteri konsorsiyumları parçacıkları stabilize eden ve besin tutulumunu artıran karmaşık biyofilmler oluşturur; öncelikle diatomlar ve ilişkili bakteriler tarafından üretilen EPS matrisi, organik bileşiklerin ayrışmasını ve biyoyararlanımı olan besinlerin daha geniş ekosistem kullanımı için salınmasını kolaylaştırarak organik bileşikleri bağlar.^[73] Proteobakterileri ve siyanobakterileri içeren bu konsorsiyumlar, bu habitatlarda gözlemlenen taksonomik çeşitliliği örneklendirir.^[74]

Karasal ortamlarda biyofilmler toprakta, özellikle bitki köklerini çevreleyen toprak bölgesi olan rizosferde gelişir ve burada bitki beslenmesini artıran simbiyotik birliktelikleri teşvik eder. Kök yüzeylerindeki bakteriyel biyofilmler, EPS matrisi içinde organik asitler ve enzimler üreterek fosfor ve demir gibi mineralleri çözündürür ve bunların konakçı bitkiler tarafından alınmasını daha erişilebilir hale getirir.^[75] Temsili bir örnek, buğday köklerinde sağlam biyofilmler oluşturan, bitki büyümesini ve verimini desteklemek için azot fiksasyonunu ve genel mineral edinimini artıran Azospirillum brasilense‘dir.^[76] Bu etkileşimler sadece toprak yapısını iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda tarımsal ve doğal topraklarda karbon ve besin döngüsüne de katkıda bulunur.^[77]

Ekstrem ortamlar, Dünya’nın çeşitli habitatlarındaki dayanıklılıklarının altını çizen, zorlu koşullara adapte olmuş özelleşmiş biyofilmlere ev sahipliği yapar. Kaplıcalarda, Sulfolobus ve Acidianus cinslerindekiler gibi termoasidofilik arkeler, düşük pH’lı, yüksek sıcaklıklı sularda biyofilmler oluşturur; burada kükürt bileşiklerini oksitlerler ve EPS aracılı yapışma yoluyla topluluk stabilitesini korurlar.^[78] Benzer şekilde, derin deniz hidrotermal bacalarında, Sulfurimonas türleri gibi kükürt oksitleyen bakteriler, baca sıvılarından gelen kimyasal gradyanları kullanarak indirgenmiş kükürdü oksitleyerek kemosentetik birincil üretime yön veren yoğun örtü biyofimlerine (matlara) hakimdir.^[79] Epsilonproteobakteriler açısından zengin olan bu matlar, kükürdü döngüye sokar ve aksi takdirde çorak olan deniz tabanı ekosistemlerinde daha yüksek trofik seviyeleri destekler.^[80]

Yapısal rollerin ötesinde, biyofilmler doğal habitatlarda birincil üretim ve kirletici azaltımı dahil olmak üzere temel ekolojik işlevleri yerine getirir. Siyanobakteriyel matlar tarafından inşa edilen eski biyofilm kaynaklı yapılar olan stromatolitler, 3,5 milyar yıldan daha eski fosillerle yaşamın en eski kanıtlarından bazılarını temsil eder ve Prekambriyen okyanuslarında küresel birincil üretimin itici gücü olarak oksijenik fotosentezi gösterir.^[81] Aşırı tuzlu lagünler gibi modern bağlamlarda, benzer mikrobiyal matlar karbonu fikse ederek ve tortuları oksijenlendirerek bu mirası sürdürür.^[82] Ek olarak, biyofilmler, ağır metalleri ve organik kirleticileri EPS matrislerine hapsederek doğal biyoremediyasyona yardımcı olur; burada mikrobiyal konsorsiyumlar kirleticileri enzimatik süreçlerle parçalayarak, insan müdahalesi olmadan toprakları ve suları detoksifiye eder.^[83] Bu işlev, biyofimlerin ölçekler boyunca çevresel sağlığı korumadaki ayrılmaz rolünü vurgular.^[84]

Taksonomik Dağılım

Biyofilmler ağırlıklı olarak prokaryotik mikroorganizmalar tarafından oluşturulur ve bakteriler çeşitli ortamlarda en yaygın katkıda bulunanları temsil eder. Hemen hemen tüm bakteri türleri, mikrobiyal bir yaşam tarzı olarak yaygınlıklarının altını çizen biyofilm oluşturma genetik mekanizmasına sahiptir.^[85] Bakteriyel şubeler arasında Proteobakteriler ve Firmicutes, metabolik çok yönlülükleri ve yapışma özellikleri nedeniyle çeşitli ortamlarda mikrobiyal konsorsiyumların önemli bir bölümünü oluşturarak biyofilm topluluklarında sıklıkla baskındır.^[86] Methanosaeta ve Methanobacterium cinslerindekiler gibi özellikle metanojenik türler olan arkeler de, özellikle metan üretimine ve türler arası etkileşimlere katkıda bulundukları anaerobik koşullarda biyofilmler oluşturur.^[87]

Olgun biyofilmler genellikle, topluluk istikrarını ve işlevini artıran karmaşık etkileşimleri yansıtan, 100 ila 1.000’den fazla farklı taksondan oluşan konsorsiyumları içeren yüksek taksonomik çeşitlilik sergiler.^[88] Bu çeşitlilik, besin döngüsünde iş bölümüne ve çevresel streslere karşı korumaya izin veren birden fazla türün toplanmasından kaynaklanır. Prokaryotlar baskın olsa da, biyofilmler sıklıkla mantarlar ve algler dahil olmak üzere ökaryotik mikroorganizmaları da bünyesine katarak ekolojik rolleri genişleten karma topluluklar oluşturur; örneğin likenler, mantar hiflerinin yapılandırılmış, dirençli matrisler oluşturmak için alg fotobiyontlarıyla bütünleştiği simbiyotik biyofilmleri temsil eder.^[89]

Biyofilm oluşturma yeteneği, çeşitli bakterilerde ilk yapışmayı ve matris montajını kolaylaştıran psl operon benzeri kümeler gibi hücre dışı polimerik madde (EPS) üretiminde rol oynayan homolog genlerin kanıtladığı üzere, mikrobiyal şubeler arasında evrimsel olarak korunmuştur.^[90] Polisakkarit biyosentezi için olanlar da dahil olmak üzere bu korunmuş genetik elementler, erken mikrobiyal evrimden bu yana devam eden ortak bir mekanik temeli vurgulayarak hem prokaryotlarda hem de karma konsorsiyumlarda yüzey ilişkili büyümeye adaptasyonu mümkün kılar.^[91]

İnsan Sağlığı ve Hastalıklarda Biyofilmler

Bulaşıcı Hastalıklardaki Rolü

Biyofilmler, bakterilerin konakçı dokularına ve ilk tutunmanın genellikle yüzeyi kaplayan konakçı proteinleriyle etkileşimler yoluyla gerçekleştiği kateterler gibi vücut içi tıbbi cihazlara yapışmasını sağlayarak bulaşıcı hastalıkların patogenezinde merkezi bir rol oynar.^[92] Bu yüzey kolonizasyonu, mikroorganizma topluluklarının ortadan kaldırılması zor inatçı enfeksiyonlar oluşturmasına izin vererek biyofilm oluşumunu başlatır. Biyofilm gömülü hücreleri çevreleyen hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi, bakterileri lökositler tarafından fagositoz dahil olmak üzere konakçı bağışıklık tepkilerinden koruyan fiziksel bir bariyer görevi görür.^[93] Örneğin, EPS bileşenleri bağışıklık hücreleri tarafından yutulmaya karşı mekanik koruma sağlayarak konakçı ortamında bakteriyel hayatta kalmayı teşvik eder.^[94]

Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından %60-80 oranında tahmin edilen bakteriyel enfeksiyonların önemli bir kısmı biyofilmleri içerir ve nükseden ve inatçı inflamasyon yoluyla osteomiyelit gibi durumların kronikliğine katkıda bulunur.^[95] Biyofilmler, bakterilerin metabolik aktiviteyi azaltan ve böylece aktif olarak bölünen hücreleri hedef alan antibiyotiklerin etkinliğini azaltan metabolik uyku durumlarına veya “persister” (inatçı) hücrelere girdiği mikro ortamlar yaratarak kronik enfeksiyonları besler.^[96] Ek olarak, biyofilm matrisi içindeki hücre dışı DNA (eDNA), polimorfonükleer lökositlerle etkileşime girerek bağışıklık tepkilerini modüle eder ve potansiyel olarak iltihaplanma ve bağışıklık temizleme mekanizmalarını bakteriyel kalıcılığı destekleyecek şekilde değiştirir.^[97]

Biyofilm ilişkili enfeksiyonların klinik sonuçları derindir; cihazla ilgili enfeksiyonlar artan riskleri örneklendirmektedir. Bunlar genellikle uzun süreli hastanede kalışlara, Amerika Birleşik Devletleri’nde yıllık yaklaşık 100 milyar dolar olduğu tahmin edilen yüksek tedavi maliyetlerine ve artan ölüm oranlarına yol açar.^[98] Bu tür enfeksiyonlar, birçok durumda cihazın çıkarılmasını gerektirerek ve tekrarlayan ataklar ve antibiyotik başarısızlıkları yoluyla genel sağlık yüklerine katkıda bulunarak standart terapötik yaklaşımları zorlaştırır.^[99]

Spesifik Patojenik Örnekler

Pseudomonas aeruginosa, kistik fibrozis (KF) hastalarının akciğerlerinde biyofilmler oluşturarak kronik solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan önemli bir fırsatçı patojendir. KF hava yollarında P. aeruginosa, mukoit fenotipe katkıda bulunan ve koruyucu bir hücre dışı matris oluşturarak biyofilm stabilitesini artıran aljinat aşırı üretimi dahil olmak üzere fenotipik adaptasyona uğrar. Aljinat açısından zengin bu matris, bakteriyel toplulukları konakçı bağışıklık tepkilerinden ve tobramisin gibi antibiyotiklerden koruyarak enfeksiyonları inatçı ve ortadan kaldırılması zor hale getirir.^[100]^[101] Çekirdek çoğunluğu algılama (QS) sistemleri, özellikle Las ve Rhl sistemleri, P. aeruginosa‘da biyofilm oluşumunu ve virülans faktörü ekspresyonunu düzenler; QS kusurlu mutantlar, KF akciğer modellerinde azalmış biyofilm gelişimi ve zayıflatılmış virülans sergiler, bu da QS’nin terapötik müdahale için kilit bir hedef olduğunun altını çizer.^[102]^[103]

Staphylococcus aureus, metisiline dirençli suşlar (MRSA) dahil olmak üzere, vücut içi tıbbi cihazlar ve dokular üzerinde sıklıkla biyofilmler oluşturarak implantla ilişkili enfeksiyonlara katkıda bulunur. ica operonu, hücre yapışmasını teşvik eden ve antimikrobiyallerden koruyan biyofilm matrisinin kritik bir bileşeni olan poli-N-asetilglukozamin (PNAG) veya diğer adıyla polisakkarit hücreler arası adhezin (PIA) sentezi için enzimleri kodlar. Kardiyak enfeksiyonlarda, kalp kapakçıkları üzerindeki MRSA biyofilmleri, matrisin bakteriyel kalıcılığı artırdığı ve cerrahi ve antibiyotik tedavilerini zorlaştırdığı enfektif endokarditte rol oynar.^[104]^[105]^[106]

Escherichia coli, özellikle üropatojenik suşlar (UPEC), idrar yollarını kolonize etmek için biyofilmleri kullanarak tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonlarına (İYE) neden olur. Tip 1 ve P fimbrialar gibi fimbrialar, üroepitelyal hücrelere ilk tutunmaya aracılık ederek kateter yüzeylerinde ve mesane mukozasında biyofilm kurulumunu kolaylaştırır. Bu yapılar, UPEC’in idrar akışına ve antibiyotik penetrasyonuna direnen çok katmanlı topluluklar oluşturmasını sağlayarak genitoüriner sistemdeki enfeksiyonu uzatır.^[107]^[108]^[109]

Streptococcus pneumoniae, pnömoni ve otitis media (orta kulak iltihabı) dahil olmak üzere solunum yolu enfeksiyonlarında biyofilmler oluşturur. Orta kulakta, pnömokok biyofilmleri mukoza epiteline yapışarak, etkilenen hastalardan alınan biyopsi örneklerinde gözlemlendiği gibi antibiyotiklerden ve bağışıklık temizliğinden kaçarak kronik otitis mediaya katkıda bulunur. Bu biyofilmler ayrıca, alveolar yüzeylerde bakteriyel kalıcılığı teşvik ettikleri pnömoni sırasındaki akciğer enfeksiyonlarında da rol oynar.^[110]^[111]^[112]

Serratia marcescens, biyofilmlerin bulaşmayı ve kalıcılığı artırdığı kateterleri ve ventilatörleri içeren hastane ortamlarında özellikle nozokomiyal (hastane kaynaklı) salgınlarla ilişkilidir.^[113]^[114]

Uygulamalar ve Etkiler

Tıbbi ve Terapötik Kullanımlar

Biyofilmler, özellikle iyileşmeyen kronik yaraların yaklaşık %78’inde rol oynadıkları kronik enfeksiyonların tedavisinde tıbbi ortamlarda önemli zorluklar yaratmaktadır. Bu yapılar, bakterileri konakçı bağışıklık tepkilerinden ve antimikrobiyal ajanlardan koruyan koruyucu bir matris sağlayarak inatçı enfeksiyonlara katkıda bulunur, bu da biyofilm ilişkili kronik ve tekrarlayan mikrobiyal hastalıklarda tedavi zorluklarına ve yüksek nüks oranlarına yol açar. Örneğin, kistik fibrozis hastalarında, akciğerlerdeki Pseudomonas aeruginosa biyofilmleri, bu toplulukların hastalığın ilerlemesini nasıl şiddetlendirdiğini ve geleneksel tedavilere nasıl direndiğini örneklemektedir.

Ortaya çıkan terapötik stratejiler, yok etmeyi artırmak için biyofilm bütünlüğünü ve bakteriyel iletişimi hedefler. Dispersin B gibi matris parçalayıcı enzimler, hücre dışı polimerik maddedeki poli-β(1-6)-N-asetil-D-glukozamini hidrolize ederek önceden oluşturulmuş biyofilmleri dağıtır ve yara spreyi olarak uygulandığında antibiyotiklere duyarlılığı artırır. Halojenli furanonlar dahil olmak üzere çekirdek çoğunluğu algılama (quorum sensing) inhibitörleri, P. aeruginosa‘daki LasR/I sistemi gibi bakteriyel sinyal yollarını bozarak hücreleri doğrudan öldürmeden biyofilm oluşumunu ve virülans faktörü ekspresyonunu azaltır. Faj tedavisi, biyofilmlere nüfuz eden, gömülü bakterileri parçalayan ve matrisi bozmak için depolimeraz enzimleri üreten bakteriyofajları kullanır ve yara ve cihazla ilişkili enfeksiyonların klinik öncesi modellerinde patojenik biyofimlere karşı etkinlik gösterir.

Tanısal gelişmeler, tedaviyi yönlendirmek için erken biyofilm tespitini kolaylaştırır. Genellikle floresan boyama ile birleştirilen konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), klinik örneklerde biyofilm mimarisinin ve canlılığının üç boyutlu olarak görüntülenmesini sağlayarak, yapıyı bozmadan inatçı enfeksiyonların tanımlanmasına yardımcı olur.

2020 sonrası araştırmalar, biyofilm penetrasyonunu ve terapötik sonuçları iyileştirmek için nanopartikül tabanlı dağıtım sistemlerini ilerletti. Bu sistemler, antibiyotikleri veya enzimleri kapsülleyerek matris bozulmasını ve bakteriyel öldürmeyi artırır; örneğin, fotodinamik ajanlarla birleştirilen gümüş nanopartiküller, çoklu ilaca dirençli enfeksiyonlarda biyofilm biyokütlesinde %80’e varan azalma göstermiştir. 2025 itibariyle, yapay zeka (AI) destekli görüntüleme ve mühendislik ürünü faj kokteylleri, çoklu ilaca dirençli enfeksiyonlar için klinik çalışmalarda %90’ın üzerinde biyofilm bozulması sağlamada umut vaat etmiştir.^[115] Enzimleri, fajları veya nanopartikülleri antibiyotiklerle birleştiren kombinasyon tedavileri, birden fazla biyofilm bileşenini sinerjik olarak hedefleyerek in vitro ve ex vivo modellerde eradikasyon oranlarını %50-80 oranında artırmıştır.

Endüstriyel ve Çevresel Uygulamalar

Biyofilmler, endüstriyel süreçlerde, özellikle damlatmalı filtreler gibi sistemlerde nitrifikasyon yoluyla amonyağın nitrite ve nitrata biyolojik oksidasyonunu kolaylaştırdıkları atık su arıtımında çok önemli bir rol oynar.^[116] Bu sabit film biyoreaktörleri, amonyak oksitleyen ve nitrit oksitleyen bakterilerden oluşan yoğun mikrobiyal toplulukları destekleyerek, oksijen mevcudiyeti ve substrat yüklemesinin optimal koşulları altında tipik olarak günde 0,2 ila 1,6 g N/m² arasında değişen nitrifikasyon oranlarına ulaşır.^[117] Bu süreç, kentsel ve endüstriyel atık sularda azot giderim verimliliğini artırarak alıcı sularda ötrofikasyon risklerini azaltır.^[118]

Biyoyakıt üretiminde biyofilmler, organik substratları biyogaza veya biyoetanole dönüştürmek amacıyla biyokütle tutulumunu ve süreç stabilitesini iyileştirmek için anaerobik biyoreaktörlerde kullanılır. Anaerobik hareketli yataklı biyofilm reaktörleri (AnMBBR’ler) ve biyofilm taşıyıcılı yukarı akışlı anaerobik çamur yatağı sistemleri, askıda büyüme sistemlerine kıyasla daha yüksek metan verimi ve toksik inhibitörlere karşı direnç gösterirken, incelemeler yenilenebilir enerji uygulamaları için ölçeklenebilirliklerini vurgulamaktadır.^[119] Örneğin, biyofilm tabanlı singaz (syngas) fermantasyonunun, yüksek hücre yoğunluklarını koruyarak kimyasal üretim oranlarını artırdığı gösterilmiştir.^[120]

Tersine, biyofilmler, boru içlerinde birikerek artan hidrolik direnç ve yüzey pürüzlülüğü nedeniyle akış oranlarını %20-50 oranında azaltan biyokirlenme (biofouling) yoluyla endüstriyel ortamlarda önemli zorluklar yaratır.^[121] Su dağıtım ve soğutma sistemlerinde bu durum enerji verimsizliklerine ve bakım maliyetlerine yol açar. Ek olarak, biyofilmlerdeki sülfat indirgeyen bakterilerin aracılık ettiği mikrobiyolojik olarak etkilenen korozyon (MIC), metal bozulmasını hızlandırarak yalnızca petrol ve gaz sektöründe yıllık küresel ekonomik kaybın 3-7 milyar dolar olduğu tahmin edilmekte ve MIC, toplam korozyon hasarlarının %10-20’sini oluşturmaktadır.^[122]^[123]

Gıda endüstrisinde, süt tesislerindeki paslanmaz çelik veya kauçuk gibi işleme yüzeylerinde Listeria monocytogenes gibi patojenler tarafından oluşturulan biyofilmler, bozulmayı ve inatçı kontaminasyonu teşvik ederek ürün geri çağırmalarına ve sağlık risklerine yol açar.^[124] Bu biyofilmler, temizleme protokollerinden sağ çıkan hücreleri barındıran hücre dışı matrisleri nedeniyle dezenfektanlara direnç gösterir. Ancak kontrollü biyofilmler, yüzeylerdeki mikrobiyal konsorsiyumların laktik asit bakterisi topluluklarını stabilize ederek peynir veya yoğurt gibi ürünlerde aroma gelişimini artırdığı fermantasyon süreçlerinde faydalıdır.^[125]^[126]

Su ürünleri yetiştiriciliği sistemleri, balık atıklarından kaynaklanan toksik amonyağı oksitlemek için biyofiltrelerdeki biyofilmlerden yararlanır, devridaim kurulumlarında su kalitesini korur ve sürdürülebilir balık çiftçiliğini destekler. Bu filtrelerdeki nitrifikasyon yapan biyofilmler, amonyağı yüksek yoğunluklu stoklama için yeterli oranlarda daha az zararlı nitrata dönüştürerek su değişimi ihtiyaçlarını %99’a kadar azaltır.^[127] Sorunlu tarafta ise, biyofilmler su ürünleri ağlarında ve gemilerde gövde kirlenmesine neden olarak sürtünmeyi artırır ve gemi yakıt verimliliğini %10-40 oranında azaltır; %5’lik bir kaplamanın bile emisyonlarda %14’lük bir artışla bağlantılı olduğu görülmüştür.^[128]^[129]

Çevresel iyileştirme için, yapay sulak alanlardaki biyofilmler, biyosorpsiyon ve çökeltme yoluyla ağır metalleri izole eder; mikrobiyal hücre dışı polimerik maddeler, yeraltı sularına sızmayı önlemek için bakır ve kurşun gibi iyonları bağlar. Yüzey altı akışlı sulak alanlar, uzun vadeli stabilizasyon için biyofilm-bitki etkileşimlerinden yararlanarak endüstriyel atık sulardaki metaller için %70-95 oranında giderme verimliliği sağlar.^[130]^[131] Bu doğal hafifletme, kirlenmiş alanlarda ekosistem restorasyonunu destekler.

Ökaryotik Biyofilmler

Ökaryotlarda Oluşum

Ökaryotlarda biyofilm oluşumu, mikrobiyal hücrelerin kendi ürettikleri hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi içinde yapışmasını, çoğalmasını ve olgunlaşmasını içerir ve genellikle prokaryotik süreçlerden farklı çok hücreli gelişimsel geçişler sergiler. Mantarlar, algler ve protozoalar tarafından oluşturulan ökaryotik biyofilmler, tipik olarak spesifik adhezinler aracılığıyla yüzey tutunmasıyla başlar, ardından hücreleri gömen ve topluluk yapılanmasını kolaylaştıran EPS üretimi gelir. Bu süreçler, besin mevcudiyeti ve konakçı etkileşimleri gibi çevresel ipuçlarından etkilenerek hayatta kalmayı ve dağılmayı artıran sağlam, üç boyutlu mimarilere yol açar.^[132]

Mantar biyofilmlerinde, özellikle Candida albicans‘ta ilk tutunma, fibrinojen ve diğer ligandlarla etkileşimler yoluyla konakçı dokularına veya abiyotik yüzeylere bağlanan ALS (aglütinin benzeri dizi) protein ailesi gibi adhezinler aracılığıyla gerçekleşir. Sonraki çoğalma, yapısal bütünlük ve penetrasyon yetenekleri sağlayan yoğun hif ağları oluşturan maya-hif morfolojik değişimini içerir. Bu biyofilmlerdeki EPS matrisi, antifungal ajanlara ve bağışıklık tepkilerine karşı koruma sağlamak için olgunlaşma aşamasında salgılanan mannanlar, β-1,3-glukanlar ve proteinlerden oluşur. Bu hif-EPS mimarisi, istilacı büyümeyi ve farnesol sinyali yoluyla çekirdek çoğunluğu algılamayı (quorum sensing) mümkün kılarak daha basit bakteriyel agregatlardan ayrılır.^[133]^[134]^[135]^[136]

Navicula ve Amphora türleri gibi ökaryotik diatomların hakim olduğu alg biyofilmleri, ışığa bağımlı yapışma ve EPS sentezi yoluyla su ortamlarında oluşur. Diatomlar, hücreleri kayalar veya tortular gibi substratlara sabitleyen sülfatlı polisakkaritler açısından zengin müsilaj yastıkları aracılığıyla tutunur, ardından çok katmanlı topluluklar oluşturan hızlı hücre bölünmesi gelir. Nötr ve asidik polisakkaritler de dahil olmak üzere EPS üretimi, biyofilmi kayma kuvvetlerine ve kurumaya karşı stabilize etmek için yüksek ışıma altında yukarı regüle edilir ve bileşimi ışık yoğunluğuna göre değişir — örneğin, matris viskozitesini artırmak için yüksek ışık altında artan karbonhidrat içeriği. Bu fototrofik biyofilmler genellikle diğer ökaryotlarla bütünleşerek matlardaki besin döngüsünü teşvik eder.^[137]^[138]^[139]^[140]

Protozoalar, ökaryotik biyofilmlere temel olarak, amiplerin (Acanthamoeba castellanii) EPS matrisine gömülürken bakteriyel bileşenlerle beslendiği karma topluluklara entegrasyon yoluyla katkıda bulunur. Protozoa etkili biyofimlerde tutunma, yüzey teması için psödopodiyal (yalancı ayak) uzantıları ve ardından topluluk direncini güçlendiren kist oluşumunu içerir. Bu topluluklarda amipler, avlanma yoluyla bakteriyel popülasyonları modüle ederek, protozoan otlatmanın bakteriyel aşırı büyümeyi azalttığı ancak genel stabiliteyi artırdığı atık su sistemlerinde görüldüğü gibi, biyofilm yoğunluğunu ve çeşitliliğini dolaylı olarak şekillendirir. Bu dinamik etkileşim, protozoaların tek türe özgü biyofilmler oluşturmasına gerek kalmadan dengeli bir ökaryotik-prokaryotik arayüzü destekler.^[141]^[142]^[143]^[144]

Ökaryotik biyofilmlerdeki gelişimsel aşamalar bakteriyel fazlara —tutunma, mikrokoloni oluşumu, olgunlaşma ve dağılma— paraleldir ancak mantarlardaki dimorfizm gibi ökaryotlara özgü çok hücreli geçişleri içerir. Örneğin C. albicans‘ta erken tutunma (0-2 saat), hif uzamasına (4-12 saat), EPS birikimine (12-24 saat) ve nihayetinde Efg1 gibi transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenen maya tomurcuklanması yoluyla dağılmaya geçer. Bu aşamalar, morfogenez için ökaryotik sinyalleşmeden yararlanarak prokaryotik modellerden farklılaşır ve mukoza yüzeyleri gibi nişlere adaptasyonu sağlar.^[132]^[145]^[146]

Örnekler ve Önem

Tıbbi bağlamda Candida türleri, idrar kateterleri gibi vücut içi tıbbi cihazlarda biyofilmler oluşturarak, koruyucu hücre dışı matris nedeniyle antifungal tedavilere karşı oldukça dirençli olan inatçı enfeksiyonlara yol açar.^[147] Kateter ilişkili idrar yolu enfeksiyonları (CAUTI’ler), nozokomiyal enfeksiyonların yaklaşık %40’ını oluşturur ve Candida biyofilmleri mantar kaynaklı CAUTI’lerin başlıca nedenidir.^[148]

Çevresel olarak, likenlerin hakim olduğu biyolojik toprak kabukları, parçacıkları bağlayarak ve erozyonu azaltarak kurak ve yarı kurak toprakların dengelenmesinde çok önemli bir rol oynar, böylece kurak alanlarda ekosistem bütünlüğünü korur.^[149] Benzer şekilde, arıtma tesislerindeki membranlar gibi su sistemlerindeki alg biyofilmleri, su akışını ve kalitesini bozan ciddi kirlenmeye neden olarak tuzsuzlaştırma tesisleri gibi altyapılarda operasyonel verimsizliklere yol açabilir.^[150]

Endüstriyel olarak, Saccharomyces cerevisiae tarafından oluşturulan maya biyofilmleri, Baijiu üretimi gibi fermantasyon süreçlerinde esterler gibi aroma bileşiklerinin üretimine katkıda bulunur.^[151] Ancak, soğutma kuleleri gibi diğer ortamlarda maya ve mantar biyofilmleri, ekipman verimliliğini ve ürün güvenliğini tehlikeye atabilen mikrobiyal kontaminasyonu ve korozyonu kolaylaştırarak bozulmayı teşvik eder.^[152]

Ökaryotik biyofilmlerin önemi, besin edinimini ve hayatta kalmayı iyileştiren simbiyotik alışverişler yoluyla çevresel streslere karşı genel dayanıklılığı artıran karma topluluklardaki prokaryotlarla etkileşimlerine kadar uzanır.^[153] Ayrıca bu biyofilmler, özellikle karbonu fikse eden ve ekosistemlerdeki daha geniş biyojeokimyasal süreçleri destekleyen alg ve liken bileşenleri aracılığıyla, birincil üretim ve organik madde ayrışmasını kolaylaştırarak küresel karbon döngüsüne katkıda bulunur.^[154]

Araştırma ve Yetiştirme Yöntemleri

In Vitro Yetiştirme Cihazları

In vitro yetiştirme cihazları, araştırmacıların biyofilmleri kontrollü laboratuvar koşulları altında büyütmelerini sağlayarak, in vivo ortamların karmaşıklığı olmadan oluşum, yapı ve uyaranlara yanıtın incelenmesine olanak tanır. Bu sistemler, basit statik kurulumlardan dinamik akış tabanlı reaktörlere kadar çeşitlilik göstererek yüksek verimli taramayı, kayma gerilimi simülasyonunu ve gerçek zamanlı gözlemi kolaylaştırır. ASTM International yönergelerinde özetlenenler gibi standartlaştırılmış protokoller, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği sağlar.

96 kuyucuklu mikrotiter plaka deneyi gibi statik modeller, basitlikleri ve biyofilm oluşumu ile antimikrobiyal etkinliğin yüksek verimli taranmasına uygunlukları nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir. Bu yöntemde bakteriler büyüme ortamı içeren kuyucuklara aşılanır, yapışma ve olgunlaşmaya izin vermek için statik olarak inkübe edilir ve biyofilm üreten suşların ve inhibitörlerin test edilmesinde etkili olan, ancak olgun, üç boyutlu yapılardan ziyade öncelikle ilk yapışmayı yakalayan kristal viyole boyaması (boyanın hem hücrelere hem de hücre dışı matrise bağlandığı, ardından çözündürme ve 595 nm’de absorbans ölçümü) yoluyla biyokütle nicelleştirilir.^[155]

Akış sistemleri, doğal veya klinik ortamlarda karşılaşılan hidrodinamik koşulları taklit ederek daha gerçekçi biyofilm gelişimini teşvik eder. Çıkarılabilir kuponlara (örneğin silikon veya titanyum) sahip standartlaştırılmış bir cihaz olan CDC biyofilm reaktörü, besin ortamını kontrollü kayma kuvvetleri (tipik olarak yaklaşık 3–4 dyn/cm²) altında dolaştırır.^[156] Bu, vasküler veya idrar yolu ortamlarını simüle ederek antimikrobiyal testler için olgun, heterojen biyofimlerin büyümesini sağlar. Benzer şekilde, damlatma akış reaktörü (drip-flow reactor), ortamın eğimli yüzeylere aralıklı olarak damlatılmasıyla düşük kayma koşulları (hava-sıvı arayüzüne yakın) oluşturarak kronik yaraları veya endüstriyel boru hatlarını taklit eder ve tekrarlanabilir mimariye sahip çok türlü biyofilmleri destekler.^[157]

Gelişmiş cihazlar, ayrıntılı araştırmalar için gelişmiş hassasiyet sunar. Genellikle polidimetilsiloksandan (PDMS) üretilen mikroakışkan platformlar, ayarlanabilir akış hızları ve besin gradyanları altında biyofilm dinamiklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesine izin vererek, toplu sistemlerde gözlemlenemeyen uzay-zamansal gen ekspresyonunu ve antibiyotik penetrasyonunu ortaya çıkarır. Endüstriyel ölçekli çalışmalar için, dönen tamburlu reaktörler (rotating drum reactors), atık su arıtma simülasyonlarını ve biyokütle üretim optimizasyonunu kolaylaştırarak, yüksek biyokütle yüklemesini korurken orta dereceli kayma uygulamak için biyofilm kaplı taşıyıcıları sıvı bir ortamda döndürür.^[158]^[159]

Yararlılıklarına rağmen, in vitro cihazlar; in vivo görülen üç boyutlu mimarileri ve konakçı etkileşimlerini tam olarak kopyalayamayan iki boyutlu substratların baskınlığı dahil olmak üzere sınırlamalarla karşılaşmakta ve potansiyel olarak biyofilm direncini olduğundan az tahmin etmektedir. Ortam bileşimi, aşılama yoğunluğu ve akış parametrelerindeki varyasyonlar nedeniyle standardizasyon, çalışmalar arasında doğrudan karşılaştırmaları engelleyerek zor olmaya devam etmektedir. Bu modeller genellikle kapsamlı karakterizasyon için yetiştirme sonrası analitik tekniklerle birleştirilir.^[160]^[161]

Analitik Teknikler

Biyofilm karakterizasyonu için analitik teknikler; yapıyı görselleştirmeyi, biyokütleyi ölçmeyi, canlılığı değerlendirmeyi ve mikrobiyal toplulukları profillemeyi sağlayan bir dizi mikroskopi, moleküler, işlevsel ve yeni ortaya çıkan yöntemleri kapsar. Bu yaklaşımlar, genellikle in vitro yetiştirme sistemlerinden alınan örneklere uygulanarak, kontrollü ortamlarda biyofilm mimarisini, bileşimini ve davranışını anlamak için gereklidir. Mikroskopi teknikleri doğrudan görselleştirme sağlarken, moleküler ve işlevsel testler hücresel ve hücre dışı bileşenler hakkında nicel bilgiler sunar.^[162]^[155]

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), biyofilm matrisi içindeki mekansal organizasyonu, kalınlığı ve heterojenliği ortaya çıkarmak için yaklaşık 0,2 μm voksel çözünürlüğüne ulaşarak üç boyutlu biyofilm görüntüleme için bir temel taşıdır. Genellikle floresan boyalar veya problarla birleştirilen bu optik kesitleme tekniği, kanal ağları ve hücre kümelenmesi gibi özellikleri vurgulayarak canlı biyofilmlerin tahribatsız analizine izin verir. Buna karşılık Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), hücre dışı polimerik maddeleri (EPS) ve nano ölçekte bakteriyel düzenlemeleri tasvir etmek için tipik olarak numune dehidrasyonu ve kaplamasından sonra yüksek çözünürlüklü yüzey topolojisi görüntülemede mükemmeldir. SEM, biyofilm morfolojisinin ayrıntılı görünümlerini sağlar ancak doğal yapıları değiştirebilecek bir hazırlık gerektirir.^[163]^[164]^[165]

Moleküler yöntemler, toplam bakteri yükünü yüksek hassasiyet ve özgüllükle tahmin etmek için 16S rRNA genleri gibi spesifik genetik belirteçleri hedefleyerek biyofilm biyokütlesini niceleyen kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu (qPCR) içerir. Raman spektroskopisi, etiketler olmadan kimyasal haritalamayı mümkün kılarak, genellikle hidratlı numunelerde mikrometre çözünürlüğünde titreşim spektrumları yoluyla polisakkaritler ve proteinler gibi EPS bileşenlerini tanımlayarak bunu tamamlar. Bu teknikler, biyokimyasal heterojenliğin invaziv olmayan profilini çıkarmayı kolaylaştırır.^[166]^[167]^[168]

İşlevsel testler biyofilm fizyolojisini değerlendirir; canlı hücreler için SYTO 9 (yeşil) ve ölü hücreler için propidyum iyodür (kırmızı) kullanan LIVE/DEAD boyama, genellikle CLSM ile görüntülenen membran bütünlüğüne dayalı canlılığı değerlendirir. Minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEC) deneyi, olgun biyofilmleri yüksek verimli bir formatta antimikrobiyallerle zorlayarak antibiyotik duyarlılığını belirler ve genellikle planktonik benzerlerinden 10-1000 kat daha yüksek tolerans seviyelerini ortaya çıkarır.^[169]^[170]^[171]

2020’lerde ortaya çıkan yaklaşımlar, mikroskopi verilerinden biyofilm heterojenliğini ölçmek için yapay zeka (AI) güdümlü görüntü analizini dahil ederek, gözeneklilik ve dağılım gibi metrikler için segmentasyonu ve özellik çıkarımını otomatikleştirip tekrarlanabilirliği artırır. Omik teknolojileri, özellikle metagenomik, etkileşimlere dair kapsamlı içgörüler için genellikle çoklu omiklerle entegre edilerek, mikrobiyal çeşitliliği ve işlevsel potansiyeli yeniden yapılandırmak üzere toplam DNA’yı sıralayarak topluluk profillemesini mümkün kılar. Bu yenilikler, polimikrobiyal biyofimlerin karmaşıklığını ele almaktadır.^[172]^[173]^[174]